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DNA的G+C含量测定



录入时间:2020-5-19 10:39:55 来源:青岛海博生物

(一)熔解温度(Tm)法

 

1.菌株培养和收集

 

  (1)固体平板法:以菌悬液接种千平皿或克氏瓶的琼脂培养基上,培养基和培养条件选其菌最合适的。一般24h(生长慢的菌可延长;芽孢菌应缩短,控制在生孢之前)后,用0.15 mol/LNaCl与0.1 mol/LEDTA (pH8.0)缓冲液洗平板,收集菌体。

  (2)液体摇瓶法:接种斜面种子于装有液体培养基的三角瓶内,置200 r/min的摇床培养16-24h后离心。以上述同样的缓冲液洗细胞,最终溶于同样的缓冲液中,浓度为2~3g湿细胞125 ml缓冲液。

 

2.DNA提取和纯化

 

  (1)将上述培养液或细胞悬液离心收集细胞,并以TE缓冲液(10mmol/LTris­HCI;1m mol/LEDTA, pH8.0)洗细胞,悬浮于50m mol/LTris-HCI—5 m mol/L EDTA (pH 8.0)缓冲液中。

  (2)加溶菌酶0.5-1 mg/ml(终浓度),置37℃水浴摇床30-60 min。

  (3)加SDS(20%)至终浓度2%, 60℃水浴10 min或更长。

  (4)加5 mol/LNaCI04至终浓度为1 mol/L。

  (5)加等体积氯仿-异戊醇(24:1 v/v),振荡10 min。

  (6)离心5000 r /min, 10 min。

  (7)吸取含DNA的上清水层,加2倍体积乙醇(95%)。

  (8)用玻璃棒卷出DNA丝。

  (9)溶于0.1 SSC (0.1 SSC: 0.015 mol/LNaCl-0.0015 mol/L柠檬酸钠)。

  (10)重复5~9步骤2~3次,视样品含蛋白质量而定。

  (11)加终浓度为50 µg/ml的RNA酶,(RNA酶在0.15 mol/LNaCl (pH 5.0)中80摄氏度预处理10 min,以除DNA酶)置37℃水浴摇床30 min。

  (12)加等体积氯仿-异戊醇摇10 min。

  (13)离心5000 r/min, 5 min。

  (14)吸取水相,加2倍体积乙醇(95%)。

  (15)用玻璃棒卷出DNA丝。

  (16)重复12-15直至无蛋白层。

  (17)加1 ml 3mol/LNaAC-0.001 mol/L EDTA pH 7.0。

  (18)边搅边加0.54倍体积的异丙醇。

  (19)溶于O.lSSC。DNA纯度检查:O.D值230:260:280=0.454中0.515

 

3.Tm测定

 

  (1)仪器:带加温装置的紫外分光光度计。

  (2)步骤:①心波长固定于260 nm;②将待测样品用O.lSSC稀释至OD260值于0.3~0.6间;③在波长260 nm首先记录25℃飞的吸光度(A25 )然后温度迅速上升至50℃;④每隔3~5℃记录一次;⑤OD值开始上升表示变性开始,每隔l℃稳定5 min,记录杯内温度和OD值,直至OD值不变表示变性完毕。

 

4.Tm值计算

 

  (1)热变性温度测定完成后,将记录的温度和相应光密度整理成表。

  (2)含各光密度乘相应温度的相对膨胀系数(Vt)与25℃时光密度相比Vt/V25,求得相对的光密度。

  (3)以温度为横坐标,以相对光密度为纵坐标,绘制热变性曲线。热变性曲线中点相对应的温度即为熔链温度(Tm值)。

 

5.G+C mol%含量计算

 

  0.1SSC:G+Cmol% =2.44Tm-69.3

  1SSC:G+Cmol% =2.08Tm-106.4

  注:必须以大肠埃希氏菌(E.coli K12)为参比操作对照,以核实实验误差。

 

 

(二)浮力密度法

 

  在氯化铯(CsCI)中DNA的浮力密度(ρ)与它的G+C含量呈线性增长关系。当DNA分子在CsCl溶液中高速离心时,会在CsCl密度梯度形成的一定部位形成DNA带。这个带的DNA分子密度相当于这个部位的CsCl的密度,这个带中点的DNA密度称作为它的浮力密度(ρ)。

  称固体CsCl 6.3 g溶于合适的缓冲液(0.05mol/LTris-HCl pH 7.3)调整到最终重置为10g,即密度约1.700 g/cm 3,分别使1 ml C-sCl缓冲液含2-3 µgDNA和相同量 的标准DNA,重新调密度到1.700 g/cm 3,并用折射仪作简单核算:1.700密度相当于折光指数1.3994。将溶液倒入10mm的单个分段杯放入离心机转头, 然后于分析超速离心机中逐渐加速至45,000 r/min, 25℃离心20h。利用DNA对紫外吸收来确定未知DNA密度带的位置和标准DNA密度带的位置,求得它们与离心机中心的距离(r和r0)。

  利用公式:

  ρ= ρo + 0. 0092 (r2-r20),ρ0为标准DNA密度(E.coli的ρo为1.710 g/cm3 )。根据Schildkraut公式, 求出待测DNA的G+C含量:

  ρ= 1.66 + 0.098 (G+ C)

  本文节选自《常见细菌系统鉴定手册》第十五章。

 

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