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沙门氏菌检验



录入时间:2006-6-26 16:34:11 来源:其它

   
   1 主题内容与适用范围
  本标准规定了食品中沙门氏菌的检验方法。
  本标准适用于食品和食物中毒样品中沙门氏菌的检验。
  2 引用标准
  GB 4789.28 食品卫生微生物学检验 染色法、培养基和试剂
  3 设备和材料
  3.1 天平:称取检样用。
  3.2 均质器或乳钵。
  3.3 温箱:36±1℃,42℃。
  3.4 显微镜。
  3.5 灭菌广口瓶:500mL。
  3.6 灭菌三角烧瓶:500mL,250mL。
  3.7 灭菌吸管:10mL。
  3.8 天菌平皿:90mm×15mm。
  3.9 灭菌小试管:内径3mm,长5cm。
  3.10 灭菌毛细管。
  3.11 橡皮乳头。  
  3.12 载玻片。
  3.13 酒精灯。  
  3.14 灭菌金属匙或玻璃棒。
  3.15 接种棒、镍铬丝。
  3.16 试管架、试管篓。
  4 培养基和试剂
  4.1 缓冲蛋白胨水(BP):按GB 4789.28中4.12规定。
  4.2 氯化镁孔雀绿(MM)增菌液:按GB 4789.28中4.13规定。
  4.3 四硫酸钠煌绿(TTB)增菌液:按GB 4789.28中4.14、4.15规定。
  4.4 亚硒酸盐胱氨酸(SC)增菌液:按GB 4789.28中4.16规定。
  4.5 亚硫酸铋琼脂(BS):按GB 4789.28中4.19规定。
  4.6 DHL琼脂:按GB 4789.28中4.20规定。
  4.7 HE琼脂:按GB 4789.28中4.21规定。
  4.8 WS琼脂:按GB 4789.28中4.23规定。
  4.9 SS琼脂:按GB 4789.28中4.22规定。
  4.10 三糖铁琼脂:按GB 4789.28中4.26,4.27规定。
  4.11 蛋白胨水、靛基质试剂:按GB 4789.28中3.13规定。
  4.12 尿素琼脂(pH7.2):按GB 4789.28中3.15规定。
  4.13 氰化钾(KCN)培养基:按GB 4789.28中3.16规定。
  4.14 氨基酸脱羧酶试验培养基:按GB 4789.28中3.12规定。
  4.15 糖发酵管:按GB 4789.28中3.2规定。
  4.16 ONPG培养基:按GB 4789.28中3.3规定。
  4.17 半固体琼脂:按GB 4789.28中4.30规定。
  4.18 丙二酸钠培养基:按GB 4789.28中3.7规定。
  4.19 沙门氏菌因子血清:按26种用于初步分型;57种用于进一步分型;163种用于详细分型。
  5 检验程序
  沙门氏菌检验程序如下:
  (图略)
  6 操作步骤
  6.1 前增菌和增菌
  冻肉、蛋品、乳品及其他加工食品均应经过前增菌。各称取检样25g,加在装有225mL缓冲蛋白陈水的500mL广口瓶内。固体食品可先应用均质器以8000~10000r/min打碎1min,或用乳钵加灭菌砂磨碎,粉状食品用灭菌匙或玻棒研磨使乳化,于36±1℃培养4h(干蛋品培养18~24h),移取10mL,转种于100mL氯化镁孔雀绿增菌液或四硫酸钠煌绿增菌液内,于42℃培养18~24h。同时,另取10mL,转种于100mL亚硒酸盐肮氨酸增菌液内,于36±1℃培养18~24h。
  鲜肉、鲜蛋、鲜乳或其他未经加工的食品不必经过前增菌。各取25g(25mL)加入灭菌生理盐水25mL,按前法做成检样匀液;取25mL,接种于100mL氯化镁孔雀绿增菌液或四硫磺酸钠煌绿增菌液内,于42℃培养24h;另取25mL接种于100mL亚硒酸盐胱氨酸增菌液内,于36±1℃培养18~24h。
  6.2 分离
  取增菌液1环,划线接种于一个亚硫酸铋琼脂平板和一个DHL琼脂平板(或HE琼脂平板、WS或SS琼脂平板)。两种增菌液可同时划线接种在同一个平板上。于36±1℃分别培养18~24h(DHL、HE、WS、SS)或40~48h(BS),观察各个平板上生长的菌落,沙门氏菌Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ和沙门氏菌Ⅲ在各个平板上的菌落特征见表1。
  表1 沙门氏菌属各群在各种选择性琼脂平板上的菌落特征
  (图略)
  6.3 生化试验
  6.3.1 自选择性琼脂平板上直接挑取数个可疑菌落,分别接种三糖铁琼脂。在三糖铁琼脂内,肠杆菌科常见属种的反应结果见表2。
  表2 肠杆菌科各属在三糖铁琼脂内的反应结果
  (图略)
  续表2
  (图略)
  表2说明在三糖铁琼脂内只有斜面产酸并同时硫化氢(H2S)阴性的菌株可以排除,其他的反应结果均有沙门氏菌的可能,同时也均有不是沙门氏菌的可能。
  6.3.2 在接种三糖铁琼脂的同时,再接种蛋白陈水(供做靛基质试验)、尿素琼脂(pH7.2)、氰化钾(KCN)培养基和赖氨酸脱竣酶试验培养基及对照培养基各1管,于36±1℃培养18~24h,必要时可延长至48h,按表3判定结果。按反应序号分类,沙门氏菌属的结果应属于A1、A2和B1,其他5种反应结果均可以排除。
  表3 肠杆菌科各属生化反应初步鉴别表
  (图略)
  6.3.2.1 反应序号A1:典型反应判定为沙门氏菌属。如尿素、KCN和赖氨酸3项中有1项异常,按表4可判定为沙门氏菌。如有2项异常,则按A3判定为弗劳地氏柠檬酸杆菌。
  表4
  (图略)
  注:+表示阳性;-表示阴性。
  6.3.2.2 反应序号A2:补做甘露醇和山梨醇试验,按表5判定结果。
  表5
  (图略)
  6.3.2.3 反应序号B1:补做ONPG。ONPG十为大肠埃希氏菌,ONPG-为沙门氏菌。同时,沙门氏菌应为赖氨酸+,但甲型副伤寒沙门氏菌为赖氨酸-。
  6.3.2.4 必要时按表6进行沙门氏菌生化群的鉴别。
  表6 沙门氏菌属各生化群的鉴别
  (图略)
  6.4 血清学分型鉴定
  6.4.1 抗原的准备
  一般采用1.5%琼脂斜面培养物作为玻片凝集试验用的抗原。
  O血清不凝集时,将菌株接种在琼脂量较高的(如2.5%一3%)培养基上再检查;如果是由于Vi抗原的存在而阻止了O凝集反应时,可挑取菌苔于1mL生理盐水中做成浓菌液,于酒精灯火焰上煮沸后再检查。H抗原发育不良时,将菌株接种在0.7%~0.8%半固体琼脂平板的中央,候菌落蔓延生长时,在其边缘部分取菌检查;或将菌株通过装有0.3%~0.4%半固体琼脂的小玻管1~2次,自远端取菌培养后再检查。
  6.4.2 O抗原的鉴定
  用A~F多价O血清做玻片凝集试验,同时用生理盐水做对照。在生理盐水中自凝者为粗糙形菌株,不能分型。
  被A~F多价O血清凝集者,依次用O4;O3、10;O7;O8;O9;O2和O11因子血清做凝集试验。根据试验结果,判定O群。被O3、10血清凝集的菌株,再用O10、O15、O34、O19单因子血清做凝集试验,判定E1、E2、E3、E4各亚群,每一个O抗原成分的最后确定均应根据O单因子血?宓募觳榻峁挥蠴单因子血清的要用两个O复合因子血清进行核对。
  不被A~F多价O血清凝集者,先用57种或163种沙门氏菌因子血清中的9种多价O血清检查,如有其中一种血清凝集,则用这种血清所包括的O群血清逐一检查,以确定O群。每种多价O血清所包括的O因子如下:
  O 多价 1  A,B,C,D,E,F群(并包括6,14群)
  O 多价 2  13,16,17,18,21群
  O 多价 3  28,30,35,38,39群
  O 多价 4 40,41,42,43群
  O 多价 5 44,45,47,48群
  O 多价 6 50,51,52,53群
  O 多价 7 55,56,57,58群
  O 多价 8 59,60,61,62群
  O 多价 9 63,65,66,67群
  6.4.3 H抗原的鉴定
  属于A~F各O群的常见菌型,依次用表7所述H因子血清检查第1相和第2相的H抗原。
  表7 A~F群常见菌型H抗原表
  (图略)
  不常见的菌型,先用163种沙门氏菌因子血清中的8种多价H血清检查,如有其中一种或两种血清凝集,则再用这一种或两种血清所包括的各种H因子血清逐一检查,以确定第1相和第2相的H抗原。8种多价H血清所包括的H因子如下:
  H 多价 1 a,b,c,d,i
  H 多价 2 eh,enx,enz15,fg,gms,gpu,gp,gq,mt,gz51
  H 多价 3 k,r,y,z,z10,lv,lw,lz13,lz28,lz40
  H 多价 4 1,2;1,5;1,6;1,7;z6
  H 多价 5 z4z23,z4z24,z4z32,z29,z35,z36,z38
  H 多价 6 z39,z41,z42,z44
  H 多价 7 z52,z53,z54,z55
  H 多价 8 z56,z57,z60,z61,z62
  每一个H抗原成分的最后确定均应根据H单因子血清的检查结果,没有H单因子血清的要用两个H复合因子血清进行核对。
  检出第1相H抗原而未检出第2相H抗原的或检出第2相H抗原而未检出第1相H抗原的,可在琼脂斜面上移种1~2代后再检查。如仍只检出一个相的H抗原,要用位相变异的方法检查其另一个相。单相菌不必做位相变异检查。
  位相变异试验方法如下:
  小玻管法:将半固体管(每管约1~2mL)在酒精灯上溶化并冷至50℃,取已知相的H因子血清0.05一0.1mL,加入于溶化的半固体内,混匀后,用毛细吸管吸取分装于供位相变异试验的小玻管内,候凝固后,用接种针挑取待检菌,接种于一端。将小玻管平放在平皿内,并在其旁放一团湿棉花,以防琼脂中水分蒸发而干缩,每天检查结果,待另一相细菌解离后,可以从另一端挑取细菌进行检查。培养基内血清的浓度应有适当的比例,过高时细菌不能生长,过低时同一相细菌的动力不能抑制。一般按原血清1∶200~1∶800的量加入。
  小倒管法:将两端开口的小玻管(下端开口要留一个缺口,不要平齐)放在半固体管内,小玻管的上端应高出于培养基的表面,灭菌后备用。临用时在酒精灯上加热溶化,冷至50℃,挑取因子血清1环,加入小套管中中的半固体内,略加搅动,使其混匀,俟凝固后,将待检菌株接种于小套管中的半固体表层内,每天检查结果,待另一相细菌解离后,可从套管外的半固体表面取菌检查,或转种1%软琼脂斜面,于37℃培养后再做凝集试验。
  简易平板法:将0.7%~0.8%半固体琼脂平板烘干表面水分,挑取因子血清1环,滴在半固体平板表面,放置片刻,待血清吸收到琼脂内,在血清部位的中央点种待检菌株,培养后,在形成蔓延生长的菌苔边缘取菌检查。
  6.4.4 Vi抗原的鉴定
  用Vi因子血清检查。已知具有Vi抗原的菌型有:伤寒沙门氏菌,丙型副伤寒沙门氏菌,都柏林沙门氏菌。
  6.5 菌型的判定和结果报告
  综合以上生化试验和血清学分型鉴定的结果,按照表8或有关沙门氏菌属抗原表判定菌型,并报告结果。
  表8 常见沙门氏菌抗原表
  (图略)
    附加说明:
  本标准由卫生部卫生监督司提出。
  本标准由江西省卫生防疫站负责起草。
  本标准主要起草人何晓青。
  本标准由卫生部委托技术归口单位卫生部食品卫生监督检验所负责解释。

 

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