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化妆品微生物标准检验方法金黄色葡萄球菌及注解



录入时间:2006-6-27 8:27:04 来源:其它

   
   化妆品微生物标准检验方法金黄色葡萄球菌及注解
中华人民共和国国家标准
化妆品微生物标准检验方法金黄色葡萄球菌 UDC 668:576 .85.07
(GB7918.5-87)
Standard methods of microbiological examination for cosmetics
Staphylococcus aureus
金黄色葡萄球菌在外界分布较广,抵抗力也较强能引起人体局部化脓性病灶,严重时可导致败血症,因此化妆品中检验金黄色葡萄球菌有重要意义。
1 方法提要
根据本菌特有的形态及培养物质性,应用Baird Parker平板进行分离,该平板中的氯化锂可抑制革兰氏阴性细菌生长,丙酮酸钠可刺激金黄色葡萄球菌生长,以提高检出率,并利用分解甘露醇和血浆凝固酶等特征,以兹鉴别。
2 培养基和试剂
2.1 培养基
2.1.1 SCDLP液体培养基
见GB 7918.1 - 87《化妆品微生物标准检验方法 总则》。
2.1.2 7.5%的氯化钠肉汤
成分:蛋白胨          10g
牛肉膏                 3g
氯化钠                 75g
蒸馏水               1000ml
制法:将上述成分加热溶解,调pH为7.4,分装,121℃(15 1b)15min高压灭菌。
2.1.3 Baerd Parker 平板
成分: 胰蛋白胨           10g
牛肉膏                     5g
酵母浸膏                   1g
丙酮酸钠                  10g
甘氨酸                    12g
氯化锂(LiCl·6H2O)          5g
琼脂                      20g
蒸馏水                  950ml
                       pH7.0±0.2
增菌剂的配制:30%卵黄盐水50ml与除菌过滤的1%亚碲酸钾溶液10ml&127;混合,保存于冰箱内。
制法:将各成分到蒸馏水中,加热煮沸完全溶解,冷至25℃校正pH。分装每瓶95ml,121℃高压灭菌15min。临用时加热溶化琼脂,每95ml加入预热到50℃的卵黄亚碲酸钾增菌剂5ml,摇匀后倾注平板。培养基应是致密不透明的。使用前在冰箱储存不得超过48h。
2.1.4 血琼脂培养基
成分:营养琼脂                   100ml
脱纤维羊血(或兔血)                10ml
制法:将营养琼脂加热溶化,待冷至50℃左右以无菌手续加入脱纤维羊血,摇匀,制成平板,置冰箱内备用。
2.1.5 甘露醇发酵培养基
成分: 蛋白胨                   10g
氯化钠                           5g
甘露醇                          10g
牛肉膏                           5g
0.2%溴麝香草酚蓝溶液         12ml
蒸馏水                       1000ml
制法: 将蛋白胨、氯化钠、牛肉膏加到蒸馏水中,加热溶解,调pH7.4,加入甘露醇和指示剂,混匀后分装试管中,115℃(10 1b)20min灭菌备用。
2.1.6 兔(人)血浆制备
取3.8%柠檬酸钠溶液〔121℃(15 1b)30min灭菌〕1份加兔(人)全血4份,混匀静置,2000~3000r/min离心3~5min。血球下沉,取上面血浆。
3 设备和材料
3.1 显微镜。
3.2 培养箱。
3.3 离心要。
3.4 灭菌吸管:1ml,5ml,10ml。
3.5 灭菌试管。
3.6 载玻片。
3.7 酒精灯。
4 操作步骤
4.1 增菌:取1:10稀释的样品10ml接种到90mlSCDLP液体培养基中(如无此培养基也可用7.5%氯化钠肉汤),置37℃培养箱, 培养24h。(1)
注:如无此培养基也可用7.5%氯化钠肉汤,检验含防腐剂的化妆品时,可在 1000ml此培养基中加1g卵磷脂、7g吐温80。
4.2 分离:自上述增菌培养液中,取1~2接种环,划线接种在Baird Parker氏培养基,如无此培养基也可划线接种到血琼脂平板,置37℃培养24~48。在血琼脂平板上菌落呈金黄色,大而突起,圆形,不透明,表面光滑,周围有溶血圈。在Baird Parker 氏培养基上为圆形,光滑,凸起,湿润,直径为2~3mm,颜色呈灰色到黑色,边缘为淡色,周围为一混浊带,在其外层有一透明带。用接种针接触菌落似有奶油树胶的软度。偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落,但无混浊带及透明带。挑取单个菌落分纯在血琼脂平板上,置37℃培养24H。
4.3 染色镜检:挑取分纯菌落,涂片,进行革兰氏染色,镜检。金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性菌,排列成葡萄状,无芽胞,无夹膜,致病性葡萄球菌,菌体较小,直径约为0.5~1μm。
4.4 甘露醇发酵试验:取述分纯菌落接种到甘露醇发酵培养基中,置37℃培养24h,金黄色葡萄球菌应能发酵甘露醇产酸。
4.5 血浆凝固酶试验
4.5.1 玻片法:取清洁干燥载玻片,一端滴加一滴灭菌生理盐水,另一端滴加一滴血浆,用接种环挑取待检菌落,分别在生理盐水及血浆中充分研磨混合。血浆与菌苔混悬液在5min内出现团块或颗粒状凝块时,而盐水滴仍呈均匀混浊无凝固现象者为阳性,如两者均无凝固现象则为阴性。凡玻片试验呈阴性反应或盐水滴与血浆滴均有凝固现象,再进行试管凝固酶试验。
4.5.2 试管法:吸取1:4新鲜血浆0.5ml,放入灭菌小试管中,再加入待检菌24h肉汤培养物0.5ml。混匀,放37℃温箱或水浴中,每半小时观察一次,24h之内如呈现凝块即为阳性。同时以已知血浆凝固酶阳性和阴性菌株肉汤培养物及肉汤培养基各0.5ml 1:4血浆混匀,做为对照。
5 检验结果报告
凡在上述选择平板上有可疑菌落生长,经染色镜检,证明为革兰氏阳性葡萄球菌,并能发酵甘露醇产酸。血浆凝固酶试验阳性者,可报告被检样品检出金黄色葡萄球菌。
附加说明:
本标准由中国预防医学科学院环境卫生监测所归口。
本标准由“化妆品微生物标准检验方法”起草小组起草。
本标准主要起草人刘以贤。
本标准由中国预防医学科学院环境卫生监测所负责解释
注解:
(1)增菌培养
本标准方法用SCDLP增菌液增菌,其成分中含有中和剂,抑菌效果较差,杂菌生长较多。在增菌培养基中加适量的亚碲酸钾(钠),当金黄色葡萄球菌生长时可将其还原,变为黑色,使培养液增加碱性;亚碲酸钾(钠)并可与蛋白胨中含硫氨基酸结合,形成的亚碲酸与硫的复合物,有抗细菌硫源代谢作用,因而可抑制其他细菌生长繁殖。
(2)分离培养
分离金黄色葡萄球菌的培养基有(Vogel-Johnson琼脂、Baird Parker琼脂、血琼脂、卵黄高盐琼脂、TMP琼脂等、CTFA、FDA和日本的方法均用Vogel-Johson琼脂培养基。我国食品微生物标准检验方法规定Baird Parker琼脂和血琼脂培养基。Vogel-Johnson琼脂和Baird-Parker琼脂的基本成分类似。为尊重传统习惯用法,在化妆品标准检验方法中只选用Baird-Parker和血琼脂二种培养基。现将各分离鉴别培养基的主要成分,作用机制和注意事项介绍如下:
1) Baird-Parker和Vogel-Johnson琼脂培养基中的氯化钾可抑制革兰氏阴性菌生长,丙酮酸钠可刺激金黄色葡萄球菌生长,以提高检出率。
2)血琼脂不仅适应金黄色葡萄球菌的生长,菌落较大,颜色鲜明,而且有鉴别溶血反应的作用,可作为血凝固酶试验的补充,增加致病菌株的检出机会。
3)卵黄高盐琼脂、氯化钠用量较大,渗透压高,有抑制某些细菌的生长作用。卵黄中的卵磷脂,有促进金黄色葡萄球菌的生长发育和鉴别的作用。该菌的卵磷脂酶可分解卵磷脂,因而生长的典型菌落,表面周围有月晕状油膜,底部有乳浊圈,易于鉴别,本培养基抑菌作用较小,杂菌生长较多。
表4金葡萄球菌的菌落特征
培养基
 菌落特征
 
Baird-Parker琼脂
 圆形隆起,光滑,直径为2~3mm,呈灰色到黑色,边缘色淡,周围为一混浊带,外层有一透明带。
 
血琼脂
 金黄色,圆形隆起,边缘整齐,外周有透明的深血环,直径为1~2mm。
 
卵黄高盐
 金黄色,圆形隆起,边缘整齐,直径为1~2mm,外周有卵磷脂被分解的乳浊圈。
 
TMP琼脂
 金黄色,圆形隆起,边缘整齐,直径0.7~1mm,周围有黄色环。
 
4)TMP琼脂:加有适量亚碲酸钾,多量氯化钠以及甘露醇和酚红指示剂,抑制杂菌的作用较强,应适当加大接种量,取3~5环增菌液划线。金黄色葡萄球菌可还原亚碲酸钾使之变黑,并可发酵甘露醇产酸,使指示剂变黄,以致菌落呈墨黑色,周围有黄色环,容易鉴别。亚碲酸钾的用量应注意准确,因其抑菌力较强,对金黄色葡萄球菌的生长也有一定影响,因而菌落较小。
(3)糖发酵试验:多数葡萄球菌菌株分解葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、产酸不产气,致病性葡萄球菌在厌氧条件下分解甘露醇、产酸,非致病性葡萄球菌无此作用。
(4)血浆凝固酶试验
试管法是检测葡萄球菌的胞外游离血浆凝固酶(作用于凝固酶原)。
玻片法是检测结合血浆凝固酶(作用于纤维蛋白原)。此法快速、简便,大多数中间型葡萄球菌和猪葡萄球菌呈阴性反应。金黄色葡萄球菌中有10~15%可呈阴性反应。
有学者推荐乳胶凝集试验作为快速及常规检验方法。将1:8稀释的乳胶、悬液与等量人血浆(用EDTA处理后,经甘氨酸。盐酸缓冲液作1:1000稀释)混合制成乳胶制剂。试验时将待检菌置于加盐水的玻片上,再加一滴乳胶试剂,混匀观察结果,凝集则为血浆凝固酶阳性。本法的准确如同试管法。
(5)检验报告
1)按常规程序检验,凡分离出革兰氏阳性葡萄球菌的疑似菌落,经证实可发酵甘露醇、血浆凝固酶阳性的菌株,可报告检出金黄色葡萄球菌。
2)如果分离的疑似菌落不发酵甘露醇,但血浆凝固酶阳性也可断定为检出金黄色萄葡球菌。
3)分离出的葡萄球菌疑似菌落,不发酵甘露醇、血浆凝固醇阴性,判断未检出金黄色葡萄球菌。

 

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