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| 青岛高科园海博生物技术有限公司技术资料 |
| 立克次体 |
| 录入时间:2006-6-27 8:57:36
来源：其它 |
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菌体很小，有多形性，属原核cell微生物
分为三个属：立克次体属、罗卡利马体属、柯克斯体属
第一节 概述
一、形态与结构
菌体较小，Q热 ˜最小，可通过滤菌器
多形性
G-，不易着色， Giemsa染色，两极浓染
二、代谢与繁殖
三、抵抗力
Q热˜>普氏˜>莫氏˜>斑点群>恙虫病˜
四、抗原结构：
五、遗传与变异：
Q热˜有I和II两个相， Ag能变易
六、致病性
第二节 立克次体的检验方法
一、立克次体的分离
（一）动物接种
（二）鸡胚卵黄囊培养法
二、血清学试验：
（一）外斐文氏反应：Q热，立克次体痘，战壕热，不能用外斐氏反应检测
无法区分普氏和莫氏立克次体
对复发的斑疹伤寒，轻症斑疹伤寒，15%接种疫苗后感染无法区分
（二）补体结合试验：
（三）间接血凝试验
第三节 引起人类感染的主要立克次体
一、普氏和斑疹伤寒立克次体
可用豚鼠接种区别 普氏 à流行性斑疹伤寒 莫氏à地方性斑
诊伤寒
血清学试验
二、恙虫病立克次体
三、伯纳特氏柯克斯体
PCR
在DNA聚合酶作用下
一、sPCR的原理
是一般段特异性DNA片段在体外合成的酶促反应
PCR技术的本质是体外酶促合成特异性DNA片段的一种方法。类似于体内的cell分裂中半保留复制过程。首先用
加热的方法使DNA解链成两股单链（这步也叫变性），用降温的办法使两股单链按碱基在补的原则分别与加入的
人工合成的寡核苷酸链结合（这步叫做复性）。人工合成的寡核苷酸链很短，只有15-20bp，起引导作用，又称
作引物。在反应体系DNA聚合酶作用下使反应体系中游离的单核苷酸，沿引物上端，按bp配对的规则延伸（这
步叫延伸），形成两条与模板DNA在补的半保留复制链。重复上述这种变性，复性（退失），延伸过程，可获得
更多的半保留复制链。新合成的链又可成为下次循环的模板，Q PCR以指数方式增加，经30次左右循环，可将所
需基因扩大到几百万倍。
一般PCR扩增倍数=（1+c）n
长引物片断（非特异性）以算术级数增加，短引物片断（特异物）以几何级数增加，Q可忽略
二、特点
1、灵敏度高 pgàug
2、特异性强 取决于引物与模板结合的正确性 耐热DAN聚合酶（Tage）
3、操作简便
4、省时
三、设备和试剂
1、微量离心管 管壁薄 传热快
微量加样器和吸头 2套 50-200μL 1-2μL
小型台式高速离心机10000r/min
DNA扩增代
电泳仪
紫外灯
2、试剂：高纯度的水（经过高压灭菌的双蒸水）
4种dNTP 0.2mmoL/L
10倍缓冲液（100 mmoL /L TrisHcL、500 mmoL /L KCD 、
5 mmoL /L Mgd2、1%GeL）
载样缓冲液（蔗糖40%，溴酚蓝 3maL/L NaAc 10%sos
100mg/mL蛋白EK）
电泳缓冲液（0.089md/LTris HcL 硼酸EDTA.2Na 2mmoL/L）
Tag酶 -20C保存 0.5 单位/ μL
EB（澳化乙啶） 使DAN增色
液体石蜡
四、3反应体系：组成
3核酸模板 DNTP TagE kcL Tris HcL缓冲液 Mad2引物
（一）注意事项：
原始材料中不能含蛋白酶、核酸酶，TagE抑制剂，能与DNA结合的pro
（二）引物
引物长度控制在15-30bp之内 G+C<50moL%
bp排列随机，避免5个以上嘌呤碱成嘧啶碱连续排列
避免引物内部出现二级结构
避免引物间互补性，特别是3¢端（引物=聚体）
引物的特异性 计算机进行同源性分析
每种引物浓度0.25 μmol/L
（三）四种核苷酸
每种0.2 μmol/L 浓度过高，易致延伸时，bp配对发生错误 Þ50-200μmoL/L
浓度过低，产物量¯ 不能低于10-15μmoL/L
四种浓度要均等
[dNTp]，易与Mg2+结合 [Mg2+]，TagE活性¯
（四）TagE ：
100μL反应体系 2-2.5单位/ mL
（五）Mg2+
1.5mmoL/ L [Mg2+] 特异性¯
[Mg2+]¯ TagE活性¯ ，产物量¯
（六）PCR反应所需的阳离子—K+ 、Mg2+
50 mmoL/ L 浓度 >75mmoL/ L TagE活性¯
（七）Tris HcL缓冲液
10 mmoL/ L
（八）Gel
对TagE活性起保护作用
（九）循环参数
温度，时间，周期数
五、PCR的污染
来源：标本间的交叉污染
扩增产物对后续扩增的污染—主要污染
实验室环境及操作者携带造成的污染
克服方法：分区
专用仪器、设备、试剂
进入扩增区和电泳区的物品不能进入通过区和试剂准备区
试剂小份分装，开封前可离心
使带纤维滤塞的枪头，一次性使用
勤换手套，加样宜缓勿急
每次做阴、阳性对照
污染后用稀HcL擦拭或紫外灯照射，Q可使DNA降体
用duTP取代dTTP 100μL体系加1个单元尿苷酶，可消
除扩增产物污染
解链温度可使尿苷酶失活，不影响
后续扩增
六、结果分析
琼脂糖凝胶电泳
DNA探针、标记、显色
排除假阴、阳性
七、标本处理：
cell裂解，DNA释放
其他物质的去除：¬去污剂+蛋白酶的消解方法
去污剂 裂解生物膜
蛋白酶K 使蛋白失活
加热 使蛋白酶K失活
加热或强碱裂解
®其他 包被磁珠等有表面活性物质吸收DNA，去除杂质
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