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| 青岛高科园海博生物技术有限公司技术资料 |
| 副溶血性弧菌检验步骤 （GB/T 4789.7-2008） |
| 录入时间:2008-10-8 9:33:47
来源：国家卫生部 |
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操作步骤
1.样品制备
1.1冷冻样品应在45 ℃ 以下不超过15 min或在2—5摄氏度不超过18小时解冻，若不能及时检验应放于--15摄氏度左右保存；非冷冻而易腐蚀的样品应尽可能及时检验，若不能及时检验，应置2-5摄氏度冰箱保存，在24h内检验。
1.2 鱼类和头足类动物取表面组织、肠或鳃。贝类取全部内容物，包括贝肉和体液；甲壳类取整个动物，或者动物的中心部分，包括肠和鳃，如为带壳贝类或甲壳类则应先在自来水中洗刷外壳并甩干表面水分，然后以无菌操作打开外壳，按仁上述要求取相应部分。
1.3 以无菌操作取检样25g（ml），加人3 ％氯化钠碱性蛋白栋水225 ml ，用旋转刀片式均质器以8000r/min创min 均质1min，或拍击式均质器拍击2 min ，制备成1：10的均匀稀释液。如无均质器，则将样品放人无菌乳钵中磨碎，然后放在500 mL 的灭菌容器内，加225ml 3% 氯化钠碱性蛋白胨水，并充分振荡。
2 增菌
2.1 定性检测
将上述1:10稀释液于36 ℃ 士1 ℃ 培养8h ～18h
2.2 定量检测
2.2.1 用灭菌吸管吸取1:10稀释液1 mL ，注入含右9mL 3 ％氯化钠碱性蛋白胨水的试管内，振摇试管混匀，制备1：100 的稀释液
2.2.2 另取1mL 灭菌吸管，按上述操作依次制备10倍递增稀释液每递增稀释一次，换用一支lml 灭菌吸管.
2.2.3 根据对检样污染情况的估计,选择三个连续的适宜稀释度，每个稀释度接种三支含有9ml 3 ％氯化钠碱性蛋白胨水的试管，每管接种1mL 。置36℃ 士1℃ 恒温箱内，培养8h--18h
3 分离
3.1 在所有显示生长的试管或增菌液中用接种环沾取一环，于TCBS 平板或弧菌显色培养基平板上划线分离。一支试管划线一块平板，于36 ℃ 士1 ℃ 培养18h--24h
5.3.2 典型的副溶血性弧菌在TCBSL呈圆形、半透明、表而光滑的绿色菌落，用接种环轻触，有类似口香糖的质感，直径2mm--3 mm 。从培养箱取出TCBS 平板后，应尽决（不超过1h）挑取菌落或标记要挑取的菌落。典型的副溶血性弧菌在弧菌显色培养基上呈圆形、半透明、表面光滑的粉紫色菌落，直径2mm--3 mm
4 纯培养
挑取三个或以上可疑菌落，划线3 ％氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂平板，36 ℃ 土l ℃ 培养18h--24h
5 初步鉴定
5.1 氧化酶试验：挑选纯培养的单个菌落进行氧化酶试验，副溶血性弧菌为氧化酶阳性。
5.2 涂片镜检：将可疑菌落涂片，进行革兰氏染色．镜检观察形态。副溶血性弧菌为革兰氏阴性，呈棒状、弧状、卵圆状等多形态，无芽胞，有鞭毛
5.3 挑取纯培养的单个可疑菌落，接种3 ％氯化钠三糖铁凉脂斜面并穿刺底层，35 ℃ 士1 ℃ 培养24h 观察结果。副溶血性弧菌在3 ％氯化钠三糖铁琼脂中的反应为底层变黄不变黑，无气泡，斜面颜色不变或红色加深，有动力。
5.4嗜盐性试验：挑取纯培养的单个可疑菌落．分别接种于不同氯化钠浓度的胰胨水，36 ℃ 士1 ℃ 培养24h 观察液体混浊清况。副溶血性弧菌在无氯化钠和10％氯化钠的胰胨水中不生长或微弱生长，在7 ％氯化钠的胰胨水中生长旺盛。
6 确定鉴定
6.1 生化试验：取纯培养物分别接种含3 ％氯化钠的廿露醇、赖氨酸、MR-VP 培养基，36 ℃ 士1 ℃ 培养24h -- 18h 后观察结果。隔夜培养物进行ONPG 试验。
5.6.2 API 20E 生化鉴定试剂盒或VITEK ：刮取3 ％氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂平板上的单个菌落，用生理盐水制备成浊度适当的细胞悬浮液．使用API 20E 生化鉴定试剂盒或VITEK鉴定.
7 报告
当检出的可疑菌落生化性状符合表1要求时，报告25g(ml)样品中检出副溶血性弧菌。如果进行定量检测，根据证实为副溶血性弧菌阳性的试管管数，查最可能数（MPN）检索表，报告每克(毫升）副溶血性弧菌的MPN值。副溶血性弧菌主要性状与其他弧菌的鉴别见表2 。
表1 副溶血性弧菌的生化性状革兰氏染色镜检氧化
表2 副溶血性弧菌的主要形状与其他弧菌的鉴别血清学分型（可选择） 神奈川实验
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