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| 青岛高科园海博生物技术有限公司技术资料 |
| 大肠埃希氏菌0157:H7/NM检验操作步骤（第二法）（GB/T4789.36-2008） |
| 录入时间:2008-10-8 13:52:47
来源：国家卫生部 |
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第二法免疫磁珠捕获法
1.原理
免疫磁珠捕获技术是通过对目的细菌进行选择性增菌，然后利用免疫磁珠进行选择性捕获的方法。
捕获的目的细菌被结合到由抗体包被的磁性颗粒上，收集后再将磁性颗粒涂布到选择性琼脂平板上进行分离。在cT -sMAc 平板上生长的可疑的大肠埃希氏菌O157,因为不分解山梨醇，或在E.coli O157显色琼脂平板上产生特定的酶促反应呈现颜色变化，而与其他细菌相区别。
免疫磁珠的应用，特别是在样品含有大量杂菌时，对检样中含有少量的大肠埃希氏菌O157：H7/NM的检出提供了更大的可能性。
GB/T 4789.36-2008
2操作步骤
2.1 增菌
同第一法
2.2 免疫磁珠捕获与分离
应按照生产商提供的使用说明进行免疫磁珠捕获与分离当生产商的使用说明与下面的描述可能有偏差时，按生产商提供的使用说明进行
2.2 .1 将Eppendorff 管按样品和质控菌株进行编号，每个样品使用1 支Eppendorff 管，然后插入到磁板架上。在漩涡混合器上轻轻振荡E.coli O157 免疫磁珠溶液后，用开盖器打开每支EPPendorff管的盖子，每管加入20 uL E.coli O157免疫磁珠悬液
2.2.2 取mEC + n 肉汤增菌培养物1 mL ，加入到EPPendorff 管中，盖上盖子，然后轻微振荡105 每个样品更换1 支加样吸头，质控菌株必须与样品分开进行，避免交叉污染。
2.2.3 结合在18 ℃ 一30 ℃ 环境中，将上述Eppendorff 管连同磁板架放在Dynal Mxl 样品混合器上转动或用手轻微转10 min ，使E.coli O157 与免疫磁珠充分接触。
2.2.4 捕获：将磁板插入到磁板架中浓缩磁珠。在3 min 内不断地倾斜磁板架，确保悬液中与盖子上的免疫磁珠全部被收集起来，此时，在Eppendorff管壁中间明显可见圆形或椭圆形棕色聚集物。
2.2.5 吸取上清液：取1 支无菌加长吸管，从免疫磁珠聚集物对侧深人液面，轻轻吸走上清液。当吸到液面通过免疫磁珠聚集物时，应放慢速度，以确保免疫磁珠不被吸走如吸取的上清液内含有磁珠，则应将其放回到Eppendorff管中，并重复8 24 步骤每个样品换用1 支无菌加长吸管。免疫磁珠的滑落：某些样品特别是那些富含脂肪的样品，其磁珠聚集物易于滑落到管底。在吸取上清液时，很难做到不丢失磁珠，在这种情况下，可保留50 uL ~100 uL 上清液于EpPendorff 管中如果在后续的洗涤过程中也这样做的话，脂肪的影响将减小，也可达到充分捕获的目的。
2.2.6 洗涤：从磁板架上移走磁板，在每支Eppendorff管中加入lmLPBS-Tween20 洗液，转动磁板架三次以上，洗涤免疫磁珠混合物。重复上述步骤8. 2 . 4 一8 . 2 . 6 。
2.2.7 重复上述步骤8 . 2 . 4 一8 . 2 . 5
2.2.8 免疫磁珠悬浮：移走磁板，将免疫磁珠重新悬浮在100 uL PBS 一TweenZ 。洗液中。
2.2.9涂布平板：用漩涡混合器将免疫磁珠混匀，用加样器各取50 uL 免疫磁珠悬液分别转移至CT-SMAC 平板和改良cHROMagar O157 弧菌显色琼脂平板一侧，然后用无菌涂布棒将免疫磁珠涂布平板的一半，再用接种环划线接种平板的另一半。待琼脂表面水分完全吸收后，翻转平板，于36 ℃ 士1 ℃ 培养18h 一24h
注：若CT-SMAC 平板和改良CHROMagar O157 弧菌显色琼脂平板表面水分过多时，应在37 ℃ 下干燥10 min 一20 min ，涂布时避免将免疫磁珠涂布到平板的边缘．
2.3 菌落识别
E.coli O157 : H7 / NM 在CT 一SMAC 平板和改良CHROMagar O157 弧菌显色琼脂平板上的菌落特征见5 . 2
初步生化试验：同5 . 3 。
2.4 鉴定
同第一法
2.5 结果报告
同第一法
GB/T 4789.36-2008 第一法常规培养法 第三法全自动酶联荧光免疫分析仪筛选法 第四法全自动病原菌检测系统筛选法 免疫磁珠捕获法流程图 |
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