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| 青岛高科园海博生物技术有限公司技术资料 |
| 大肠埃希氏菌0157:H7/NM检验操作步骤（第四法）（GB/T4789.36-2008） |
| 录入时间:2008-10-8 14:18:08
来源：国家卫生部 |
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| 第四法全自动病原菌检测系统筛选法
1 原理
BAX 系统利用多聚酶链反应（PCR ）来扩增并检测细菌DNA
中特异片段来判断目标菌是否存在反应所需的引物、DNA 聚合酶和核苷酸等被合并成为一个稳定、干燥的片剂，并装人PCR 管中，检测系统运用荧光检测来分析PCR 产物每个PCR 试剂片都包含有荧光染料，该染料能结合双链DNA ，并且受光激发后发出荧光信号。在检测过程中，BAX 系统通过测量荧光信号的变化，分析测量数据，从而判定阳性或阴性结果
2 仪器和材料
2.1 BAX 系统主机及工作站
2.2 仪器校正板。
2.3 带帽裂解八联管及管架。
2.4 盖帽、去帽器。
2. 5 加热槽两个。
2.6 温度计
2.7 单道加样器：20 uL 一200 uL 、5 uL 一0uL 、8 道加样器，范围为5 uL 一50 uL 及配套带滤芯的吸头
2.8 冷却槽。
2.9 PCR 管支架
2.10 打印机。
3 试剂
3.1 PCR 管。
3.2 裂解缓冲液。
3.3 蛋白酶。
3.4溶菌试剂
4 操作步骤
4.1 增菌
同第一法
GB/T4789.36 -2008
4.2 上机操作
4.2.1 打开加热槽分别至37 摄氏度 和95摄氏度 。检查冷藏过夜的冷却槽（4 摄氏度 ）。开机并启动BAX 系统软件。如果仪器自检后建议校正，按屏幕提示进行校正操作。
4.2.2 创建“rack”文件：根据提示在完整的”rack”文件和“个样”资料中输人识别数据。
4.2. 3 溶菌操作：在管架上放上标记好的溶菌管。在每支溶菌管加入200 uL
配制好的溶菌试剂。将每个增菌后的5 uL 样品加入相应的溶菌管中，盖上盖子。把管架放在37摄氏度 加热槽中20 min 。再将管架放在95 摄氏度 的第二块加热槽中10 mm 最后将管架放在冷却槽上（冷却槽从冰箱取出后30 mm 内使用完毕），样品冷却5 min 。
4.2. 4 加热循环仪／检测仪：从菜单中选择“RUN FULL PROCESS” ，加热到设定温度（加热槽90摄氏度 ，盖子100 摄氏度 ）。
4.2.5溶菌产物转移：将PCR 管支架放到专用冷却槽上，然后将PCR 管放人到支架内。将所有的管盖放松并除去一排管盖用多道加样器将50 uL 溶菌产物加入此排管中，并用替代的透明盖密封PCR 管。换用新吸头，重复上述操作，直至将所有样品转人PCR 管中
4.2.6 扩增和检测：按“PCR Wizard ”的屏幕提示，将转移后的PCR 管放人PCR 仪／检测仪中开始扩增全过程（扩增和检测）需要大约35h 当检测完成后，“PCR Wizard ”提示取出样品，并自动显示结果
4.3 结果报告
绿色“一”表示阴性结果。
红色“+ ”表示阳性结果。
黄色，' ? ”表示不确定结果。
黄色，' ? ”带斜线表示错误结果
4.4 不确定和错误结果的处理
取保存于2 -8摄氏度 的增菌肉汤重新上机检测。
4.5 阳性结果的确认
用第一法或第二法对保存于2一8摄氏度 的增菌肉汤分离鉴定确认
4.6 阴性结果的报告
阴性结果可直接报告25g(mL)样品中未检出大肠埃希氏菌O157 : H7
第一法常规培养法 第二法免疫磁珠捕获法 第三法全自动酶联荧光免疫分析仪筛选法 |
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