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U.S. Department of Health and Human Services
U.S. Food & Drug Administration
Center for Food Safety & Applied Nutrition
?Bacteriological Analytical Manual
April 2003

食品中单增李斯特氏菌的检测与计数

李斯特氏菌有6个菌种：单增李斯特氏菌、英诺克李斯特氏菌 、西尔李斯特氏菌、威尔斯李斯特氏菌、绵羊李斯特氏菌、格氏李斯特氏菌。其中格氏李斯特氏菌和绵羊李斯特氏菌含有2个亚种，不必作明确分型。Rocourt最新的细菌分类法代替了以前的分类法。绵羊李斯特氏菌与单增李斯特氏菌是老鼠和其他动物的致病菌，然而，只有单增李斯特氏菌是人类致病菌，绵羊李斯特氏菌与西尔李斯特氏菌在人类中很少见。
近来，我们充分讨论了食品中单增李斯特氏菌的存在性及其传染性，详细资料查阅HTTP:www.foodsafety.gov/~dms/lmrisk.html。而本篇重点介绍单增李斯特氏菌的鉴定与计数。食品加工过程中，例如食品接触表面及加工工具的致病原检测就不作介绍了。
分离与检测单增李斯特氏菌快速有效的方法如下：以污染的食品为样品，通常据FDA实验规则，样品是混合物。待分析的部分样品放入BLEB增菌液（奶制品放入AOAC/IDF）中，30℃培养4h，进行李斯特菌选择性增菌。在第四个小时加入选择剂：吖啶黄素（10mg/L），萘啶酮酸（40mg/L），也可加入放线菌酮（50mg/L）。然后继续培养48h，在24h和48h时，将培养物划线接种于不同的选择性培养基来分离李斯特氏菌。
有些快速检测试剂盒也可用于到李斯特氏菌的检测。先在标准增菌液或呈现阳性的增菌液中进行李斯特氏菌增菌，之后划线到选择培养基上分离培养，然后在非选择培养基上纯化，最后通过常规检测实验或一系列生化实验来确定是否为单增李斯特氏菌。利用特异性的试剂盒，分离物会快速地被鉴定是否为单增李斯特氏菌。FDA规则中，必须依照血清类型PFGE及核糖类型分类。
利用选择性培养基的菌落计数及MPN计数法可以对单增李斯特氏菌进行计数。（MPN计数法是先用BLEB选择性增菌，再涂布于ALOA或BCM选择性培养基上）

主要内容如下：

1. 增菌液及快速检测实验是可以选择的
2. 可用任一种选择分离培养基来代替两种选择性培养基（OXA 、PALLCAM 、添加七叶苷和三价铁的LPM 、MOX）。OXA仍为标准的选择分离培养基，MOX也可使用，没加七叶苷和三价铁的LPM已不再使用。BCM 、ALOA 、CHROMagar Listeria 和 Rapid' L. mono 、也会尝试着被使用，从而将单增李斯特氏菌与绵羊李斯特氏菌从其它李斯特氏菌中分离出来，并易于挑取单菌落。
3. Henry斜射光试验并不是很重要，由于其仅对不同的选择性分离琼脂有规定。
4. 目前使用的增菌液基本没有改变，与国际上通用的Asperger et al.(10a)增菌方法的第一步相似。然而，毒性小于放线菌酮的匹马菌素，作为选择性抗真菌剂,被加入到增菌液中。
5. 若食品中检测出单增李斯特氏菌，就需要计数。

?????????????????????????????????????? 图表1?? 李斯特菌的鉴别(见页码2/22)

1. 羊血琼脂穿刺；
2. 小鼠毒力实验；
3. 糖发酵培养基：发酵核糖的是绵羊李斯特氏菌亚种ivanovii，不发酵核糖的是绵羊李斯特氏菌亚种londiniensis ；
4. V，不同生物类型；
5. 硝酸盐还原试验：硝酸盐还原的是格氏李斯特氏菌亚种murrayi，硝酸盐还原的是格氏李斯特氏菌亚种grayi。

1. 设备与材料:
2. 天平称取0.1g样品
3. 盖玻片
4. 500ml三角瓶
5. 发酵管
6. 记号笔
7. 30℃和35℃的培养箱.
8. 香柏油
9. 接种环
10. 接种针
11. 载玻片
12. 直径为26mm,长为3-8尺的针

12.显微镜
13.平皿
14.25ml ,10ml ,1ml的移液管
15.16×125mm的试管及塞子
16.混匀器
17.无菌注射器

B.培养基与试剂:
1.醋酸5mol/L
2.升汞
3.琼脂
4.N-二胺乙烯
5.α-萘酚
6.二号血琼脂基础
7.放线菌酮
8. 匹马菌素
9.脱纤维羊血
10.无水乙醇
11.荧光抗体缓冲液
12.氨基乙酸
13.革兰氏染液
14. 3%过氧化氢溶液
15. 40% KOH溶液
16.血清学装置
17.加七叶苷和三价铁的LPM
18. 萘啶酮酸(钠盐)
19.硝酸盐肉汤与硝酸盐试剂
20.营养肉汤
21.0.85%生理盐水
22.糖发酵培养基
23.半固体动力培养基
24.硫酸试剂
25. TSAye培养基
26. TSBye培养基
27. OXA琼脂
28. BLEB增菌液
29. PALCAM琼脂
30. BCM培养基
31. MOX培养基
32. ALOA培养基
33.显色李斯特氏菌培养基
34. Carageenan(sigma tyjpe II)
35. Rapid L'mono
36.CHROMagar李斯特氏菌显色培养基
37.胰蛋白胨肉汤与琼脂

C.样品处理与增菌:
1.样品处理:
将样品保存于4℃冰箱中，若条件适宜，单增李斯特氏菌会缓慢生长，若样品已被冷冻，则应在进行检测前解冻
2.样品混合液的制备:
无菌操作从10个样品中各取50ml或50g，每五种样品混合成一份250ml或250g，共分两份(注意取样要均匀).两份混合液都加入250ml的BLEB增菌液中振荡混匀。每份样品匀液各取50ml(固体取25ml)分别放入200ml BLEB增菌液中，同时再各取50ml(固体取25ml)置于5℃冰箱中保存，以备计数。
3.非混合液的制备:
若不需要样品混合物，则只需取25g样品放入225ml的BLEB增菌液中，混匀，增菌培养。同时贮存25g样品以备计数。非冷冻样品，应置于5℃下保存，冷冻样品置于保鲜冰箱中保存，不能冷冻。
4.前增菌与增菌:
30℃培养4h，后加入选择性试剂，继续30℃培养48h。若没有放线菌酮也可用25mg/L的匹马菌素代替，且比放线菌酮更安全。巴氏消毒乳、乳制品、酸乳酪、冷冻水产品等，含有较少的酵母菌和较少霉菌，因此不需加入抗真菌剂。但生乳、干的海产品或新鲜产品则需加入抗真菌剂。
5.增菌与计数:
首先检测是否含有单增李斯特氏菌，若含有，则需对贮存样品进行计数。很少一部分样品被检测出是单增李斯特氏菌阳性的，大部分样品只含有1cfu/25g的单增李斯特氏菌。因此这种方法是首选的，目前将常规检测与计数结合在一起。
6.规定的增菌样品另外一种检测方法：
图表2中列举了FDA方法规定的检测单增李斯特氏菌的试剂盒，根据制造商的说明书确定其方法没有偏离AOAC官方操作手册。在第十章增刊1A中列举了FDA认可的不同食品检测试剂盒，在第十章增刊1B中列举了其它食品样品的检测，必须自行验证这些试剂盒是否适合。最简单验证方法是在试剂盒上检测为阴性的48小时增菌培养基划线接种到含七叶苷的琼脂上。甚至要求5个或更多食品样品进行验证，直至与常规的培养检测结果相符合。由于常规的培养检测方法并没有计算不同食品中竞争微生物的数量和生长情况，大量的竟争微生物将减弱快速检测试剂盒的灵敏度。快速检测试剂盒比平板培养需要较高的菌浓度，检测实验菌浓度>10000cfu/每毫升增菌液，平板培养大约100cfu每毫升增菌液。.因此会导致假阴性结果。在25克分析食品分析样品中，3个以下的单增李斯特氏菌应该在试剂盒中检测出。对于所有食品样品的检测，试剂盒的单增李斯特氏菌的阳性结果必须与培养法结果相同。
图表2? 李斯特菌的检测实验 (见页码4/22)

1. 通用常规检测:
1. AOAC Official Method 993.09. 2000. Listeria in dairy products, seafoods, and meats. Colorimetric deoxyribonucleic acid hybridization method (GENE-TRAK Listeria Assay). (3, 14)
2. AOAC Official Method 994.03. 2000. Listeria monocytogenes in dairy products, seafoods, and meats. Colorimetric monoclonal enzyme-linked immunosorbent assay method (Listeria). (5, 15, 32)
3. AOAC Official Method 995.22. 2000. Listeria in foods. Colorimetric polyclonal enzyme immunoassay screening method (TECRA Listeria Visual Immunoassay [TLVIA]). (6, 30)
4. AOAC Official Method 996.14. 2000. Assurance (Polyclonal Enzyme Immunoassay Method). (7, 21)
5. AOAC Official Method 997.03. 2000. Visual Immunoprecipitate Assay (VIP). (8, 22)
6. AOAC Official Method 999.06. 2000. Enzyme Linked Immunofluorescent Assay (ELFA) VIDAS LIS Assay Screening Method. (9, 23)

1. 非通用常规检测
1. CLEARVIEW Listeria RAPID TEST. (Oxoid Inc., Ogdensburg, NY).
2. AOAC Accredited Method. 2000. BAX Listeria test. (Qualicon, Inc., Wilmington, DE).

D:? 分离纯化:
在24和48h时,挑取BLEB上的菌落划线接种于含七叶苷的选择分离培养基上：OXA、PALCAM、MOX或加入七叶苷和三价铁的LPM。以上含七叶苷的培养基根据具体要求而选用。OXA、PALCAM、MOX平板接菌后放置于35℃培养24-48小时，含七叶苷和三价铁的LPM平板接菌后放置于30℃培养24-48小时。特别推荐以下单增李斯特氏菌与绵羊李斯特氏菌所用的选择性培养基，例如BCM(33，M117a)、ALOA(M10a)、Rapid单增李斯特氏菌培养基(M131a)、或CHROMagar 李斯特氏菌培养基(M40a)培养48小时( 也可培养24小时)，这样可以减少绵羊李斯特氏菌掩盖单增李斯特氏菌。[注：BCM培养基已被FDA证实有效。ISO TC34 SC9认证机构证实所有的培养基(和一种选择性的血琼脂培养基-LMBA，Sifin，德国 )都能或多或少地抑制非李斯特氏菌的生长。ALOA的配方已公开，其是首选培养基。Chromogenic李斯特氏菌作为一种选择性培养基其配方也会公开。
在含七叶苷的培养基上，李氏菌呈黒色，菌落周围具有黒色的环。一些其它的细菌在两天以后或更长的时间，能够形成淡棕黒色的菌落。从OXA、PALCAM、改良LPM培养基或MOX培养基上，挑取5个典型菌落划线接种到TSAye培养基上，分离纯化单菌落。同样也可划线接种到BCM培养基，单增李斯特氏菌呈蓝色，而绵羊李斯特氏菌在食品中不常见。单增李斯特氏菌和绵羊李斯特氏菌在ALOA培养基下都呈蓝色且在菌落周围有酯酶环。在传统的检测方法中，利用TSAye培养基进行菌落纯化是必须的，因为选择性培养基上分离出的菌落仍有可能包涵有其它细菌。至少挑取5个菌落，由于在同一样品中可能含有几种李斯特氏菌。BCM和ALOA培养基可以减少挑取的菌落数。运用商业的Confirmatory培养基(Biosynth International,Inc.)，或传统的木糖/鼠李糖发酵肉汤或琼脂，可以区别单增李斯特氏菌和绵羊李斯特氏菌。TSAye平板需在30℃培养24-48小时，若不需观察运动，也可在35℃培养。对于这些认可的方法，可以用选择性琼脂进行分离李斯特氏菌，也可以辅助使用推荐的新的单增李斯特氏菌-绵羊李斯特氏菌分离培养基。
E、鉴定过程
分离纯化过程可用以下经典的方法(E,1-11)，也可用快速试剂盒进行
生化试验来区别基因型或种(见-11和E-12)。

1. 检测TSAye平板上的典型菌落形态，用斜射光观察是非常有帮助，但不是必须的(详见ref.25)。
2. 从30℃或低于30℃培养的平板上挑取生长良好的典型菌落，涂于洁净载玻片上，用0.85%生理盐水制成悬浮液，压上盖玻片于相差显微镜的油镜下观察。李斯特氏菌为短杆状，有轻微的旋转和翻滚运动。而大的杆状，或快速运动的杆状细菌则不是李斯特氏菌。应用阳性的李斯特氏菌做对照。
3. 过氧化氢酶试验：李斯特氏菌阳性反应。
4. 革兰氏染色试验：将培养16-24小时的培养物进行染色。李斯特氏菌呈短杆状阳性菌。但若培养时间过长，染色会发生变化。细胞呈现Coccoidal菌现象。着色轻的部位呈现栅栏状，被当作类白喉菌排除掉。
5. 挑取典型菌落接种到TSBye培养基(进行糖发酵试验)和其它检测培养基上，35℃培养24小时，这些培养物可置于4℃冰箱中保存数天，以重复利用。商业化的试剂盒也可于分离鉴定(见E-11)。
6. 溶血试验：将7%羊血琼脂平板底面划分为20-25个小格，从TSAye上挑取菌落刺种到血平板上，每格刺种一个菌落，并刺种阳性对照菌(单增李斯特氏菌和绵羊李斯特氏菌)和阴性对照菌(英诺克李斯特氏菌)，于35℃培养24-48小时，穿刺时尽量接近底部，但不要触到底面，同时避免琼脂破裂。
7. 于明亮处观察洁净的血琼脂平板，单增李斯特氏菌和西尔李斯特氏菌在刺种点周围产生狭小的透明溶血环，英诺克李斯特氏菌无溶血环，绵羊李斯特氏菌产生大的透明溶血环。注意：不要据此来区别李斯特氏各种菌，仅仅是一种溶血现象。用CAMP试验来确证李斯特氏各种菌。(注意：当血平板的厚度比通常的5mm更薄时，非常容易观察到溶血环，另外这可以通过覆盖一层血琼脂1-2mm来实现)。
8. 硝酸盐还原试验：这个试验是非必需的。只有默氏李斯特氏菌能降解硝酸盐，从而区别开格氏李斯特氏菌和默氏李斯特氏菌。用TSBye肉汤培养物接种到硝酸盐肉汤中，35℃培养5天，加入0.2ml试剂A，再加入0.2ml试剂B，混匀，如出现紫红色，则表明降解了硝酸盐，存在亚硝酸盐。如无颜色变化，则加入少量锌粉，放置1小时，如出现红色，表明仍有硝酸盐存在，未被细菌降解。

也可按以下过程进行检测:加入0.2ml试剂A，再加入0.2ml试剂C，混匀，如出现桔红色，则表明降解了硝酸盐，存在亚硝酸盐。如无颜色变化，则加入少量锌粉，放置1小时，如出现桔红色，表明仍有硝酸盐存在，未被细菌降解。

1. 动力试验：

由TSBye肉汤培养物接种到SIM培养基或MTM培养基，室温培养7天，逐日观察，李斯特氏菌有动力，呈伞状生长。从MTM培养基上形状尤为突出，可以明显观察到伞形。另外，通过相差显微镜，可以观察30℃ TSBye培养基上的培养物的翻滚运动。

1. 糖发酵试验：

将TSBye上培养物接种于含以下0.5%糖的紫色肉汤中(可加入小倒管)：葡萄糖、七叶苷、麦芽糖、甘露醇、鼠李糖和木糖。35℃培养7天。阳性反应是产酸不产气。不同菌种的生化反应见表1。所有李斯特氏菌对葡萄糖、七叶苷、麦芽糖都是阳性反应。除格氏李斯特氏菌和默氏李斯特氏菌外的李斯特氏菌对甘露醇呈阴性反应。若OXA、PALCAM、MOX或LPM(加七叶苷和三价铁)的纯化物着色是确定的，则七叶苷发酵实验可省略。

1. 可以用商业化的试剂盒对纯培养物进行快速鉴定（用于种的鉴定时需做补通试）。有革兰氏阴性与阳性菌鉴定卡、不需CAMP试验的API、MICRO-IDTM (CAMP试验确定后，用MICRO-IDTM可区别李斯特氏菌各个种)、李斯特氏菌生物型分析卡。
2. 另一种快速鉴定李斯特氏菌的方法见图表3。用纯培养物或从OXA、其它选择性分离培养基上挑取菌落进行鉴定。单增李斯特氏菌这些分离纯化鉴定实验要作为常规实验来应用。

表3. 确证是否为单增李斯特氏菌的有用试剂盒

1. AccuProbeTM 单增李斯特氏菌培养物确证检测试剂盒(Gen-Probe,Inc,San Diego,CA;10)
2. GeneTrak 单增李斯特氏菌检测试剂盒(Neogen,Lansing,MI;19).
3. Probelia 单增李斯特氏菌检测试剂盒(BioControl,Seattle,WA).
4. VIDAS单增李斯特氏菌检测试剂盒(bioMerieux).
5. Transia单增李斯特氏菌平皿(Diffchamb SA,Lyon,France).
6. FDA,SRL的应用，PCR方法检测和鉴定单增李斯特氏菌。

??????? *这些试剂盒是适用于不同的培养时间的单增李斯特氏菌检测。若选择合适的时间，才可以用来鉴定单增李斯特氏菌的增菌物。此处，FDA只是规定了用来鉴定所有李斯特氏菌的有效试剂盒。

F、CAMP试验：当溶血试验结果不确定时，可用CAMP实验来区别李斯特氏菌的各个种。在羊血琼脂平板上划两条平行线，两条线上分别接种β型溶血金黄色葡萄球菌与马红球菌培养物。在该两线之间，垂直划线，接种待测培养物，与两线相近但不相交，于35℃培养24-48小时后，观察溶血情况。单增李斯特氏菌与西尔李斯特氏菌在靠近金黄色葡萄球菌接种点附近的溶血增强，其它李斯特氏菌不溶血。单增李斯特氏菌在24小时溶血现象比在48小时更明显。为使马红球菌能长出一条很好的划线，需要将斜面培养物培养48小时，而不是24小时。同时，羊血琼脂平板需新鲜配制。
表4 李斯特氏菌菌种协同溶血作用试验(CAMP)

G、李斯特氏菌的分类：
按FDA标准分离出的李斯特氏菌应按血清型和遗传性进行分类。
1、血清类型分类：利用标准血清类型将李斯特氏菌分为类型1、4或3、5、6等
图表5、各种李斯特氏菌的血清类型

图表5表明了李斯特氏菌各种之间的血清关系，大多数单增李斯特氏菌从病人身上获得，周围环境类型是1或4，多于90%的单增李斯特氏菌能被确定血清类型。除威尔斯李斯特氏菌外的所有非致病的菌种与单增李斯特氏菌具有同一个或多个抗原。特征不完全确定的血清类型是不能鉴别出单增李斯特氏菌的。
血清学可用于研究流行病。TSB-YE培养物接种到酪蛋白胨肉汤中，35℃培养24h，在该温度下，鞭毛（H）抗原表达能力降低。然后再接种到酪胨琼脂斜面，35℃培养24h，用3mlFA缓冲液冲洗两个琼脂斜面，并将洗液转移到无菌的16*125mm试管中，盖上塞子，80℃水浴加热1h，1600转/min离心30min，除去2.2-2.3ml的上清液，将底部的沉淀再次悬浮于剩下的缓冲液中，按说明将血清进行稀释、凝集实验。若鞭毛（H）或菌体（O）血清类型符合，看11章。
2．遗传学分类：FNA分离物的DNA限制性酶切片段的PFGE应送到PulseNet也应坚定核糖类型或送到核糖鉴定实验室。
H.小鼠毒力实验。
检测李斯特氏菌的致病性传统实验是Anton相交实验，既小鼠注射实验和鸡胚注射实验。小鼠抵抗力测定实验是将细菌从腹腔注入，该实验有很高的敏感性，单增李斯特氏菌对动物的致病性，对于临床分离来说是不需要确定的，对于食品来说是可以选择的。当分离物满足本章中列举的其他标准时，也可判定分离物为单增李斯特氏菌。
将4mgCarageenan(sigma tyjpe II)溶解在蒸馏水中，注射到18-20g重的小鼠体内，24h后，李斯特氏菌开始表现毒性。小鼠体内的Carageenan(sigma tyjpe II)注射量应依据小鼠的体积，一般注射量为；每1kg体重注射200mgCarageenan(sigma tyjpe II)，。分离物在TSB-YE中35℃培养24h后，再转移到两个管中，35℃培养24h，然后再将10ml的肉汤培养物转移到16*150管中，1600转/min离心30min，弃上清，用1ml灭菌生理盐水制成菌悬液，此时菌浓度为1010/ml，稀释105/ml，将0.1ml菌悬掖注射到16-18g重的Swiss小鼠体内，（每组5只），约注入104个菌，观察5d内小鼠的死亡情况。非致病菌不会杀死小鼠。用致病菌、非致病菌、Carageenan(sigma tyjpe II)处理的小鼠及未注射的小鼠作对照实验。每组实验用5只小鼠，Carageenan(sigma tyjpe II)处理的小鼠，应该能够忍受0.1ml的PBS。

I实验数据解释：
分离物的所有特征都不能忽视。部分特征尽管准确，但容易引起误导。所有的李斯特氏菌在吲哚实验、氧化酶实验、尿素酶实验，有机硫化物的产H2S实验（H2S是在MICRO ID实验中由硫酸盐产生的），都是阴性的，甲基红和V-P实验是阳性的，这些实验是独立的。与李斯特氏菌在种属上很相近的Brochothrix，却不能在35℃生长，因而，可将两者区别开。Erysipelothrix与Kurthia属革兰氏阳性菌，不能产生孢子且不能运动，在李斯特氏菌分析中很少见，但能在其他地方发现。
李斯特氏菌体积很小，为过氧化氢酶阴性，革兰氏阳性菌，在溶液及SIM中可以运动。他们能利用葡萄糖，七叶苷，麦芽糖。一些李斯特氏菌能利用鼠李糖。绵羊李斯特氏菌与西尔李斯特氏菌可用CAMP实验区别开。西尔李斯特氏菌在金黄色葡萄球菌线上有溶血现象，绵羊李斯特氏菌再马球菌线上有溶血现象。所有的非溶血菌中，英诺克李斯特氏菌与单增李斯特氏菌一样，能产生相同的鼠李糖-木糖反应，英诺克李斯特氏菌为CAMP实验阴性，英诺克李斯特氏菌利用木糖有时呈阴性结果。目前，普遍认同英诺克李斯特氏菌为非溶血性菌，单增李斯特氏菌为溶血性菌，因此，英诺克李斯特氏菌为溶血菌的说法是不正确的，威尔斯李斯特氏菌是木糖阴性反应，西尔李斯特氏菌为微溶血，二者可能会被混淆，但可用CAMP实验区别开。有时，异常李斯特氏菌难被确定，因此，会被分离出来（看CAM指导手册上关于典型溶血李斯特氏菌的鉴别）。若异常菌株被分离到，与Anthony Hitchins@cfsan.fda.gov联系。
注释：对于有非典型溶血现象的单增李斯特氏菌，其临床作用值得争议。如果其不溶血是取决于溶血基因序列不存在，尤其是缺乏，而不是变异，则与正常菌株相比，对临床是没有什么意义的。这些可以通过在小鼠体内注射溶血变异株来判断。然而，如果其取决于控制溶血基因在Vitro上表达的序列的丢失，那么，溶血基因在Vitro中表达的可能性会增加，在用来区分两种观点的有效方法设计出来之前，必须确定分离物是Vitro中是不溶血的单增李斯特氏菌，以便依据所有相关的实验情况作出合理的决定。
李斯特氏菌的血清型分类及其他分类法是很有意义的。生化数据、血清型数据及致病性数据在图表1，4，5中都有概括。要有足够的数据来鉴别李斯特氏菌种。FNA不再依据传统的细菌敏感性来对单增李斯特氏菌进行分类。
J．计数（要求）
若样品经实验确定含有单增李斯特氏菌，那就要用保存的那部分进行计数
目前，单增李斯特氏菌的计数方法只是设想。对分离出的李斯特氏菌进行进一步的实验是必要的。传统的计数方法已被确定，并且快速计数方法也被指明。可用这两种方法进行计数。计数方法可自由选择，但计数的准确性必须达95%以上，且要标明计数方法。同时，必须将单增李斯特氏菌占总的李斯特氏菌数的比例报道出来。
所有的计数方法，包括显微计数法、菌落计数法及MPN法
监视计数：样品中具致病性的单增李斯特氏菌要有细胞数目的累计数据。若不能计数，点击Anthony Hitchins@cfsan.fda.gov，为了确定单增李斯特氏菌的污染程度，将刚接种的增菌肉汤涂布到ALOA、BCM或相应的培养基上进行计数。当然，也可用MPN法：分别将1g、0.1g、0.01g、0.001g样品接种到BLEB中（35℃培养48h，不加 Pyravate，加或不加选择性抑制剂），然后划线到选择性培养基上，若所有的MPN管都是李斯特氏菌阳性，就用保留得样品再重复一次，MPN计数法，选择一个合适的稀释范围，可用来分析10-4、10-5、10-6、10-7、10-8等。
若选择性培养基数量不够，可选择一个有效的方法—点滴培养法。既将一个平板均匀分几部分，用移液器分别将溶液滴在不同区域，用微量移液器吸取10μl增菌培养物放在离心管中，加入90μlTSBYE，用移液器的枪头在离心管的底部轻轻搅动，混匀，并且注意，每混匀一个稀释液换一次枪头。
将10μl稀释液小心的放在ALOA、BCM或相应的培养基上，在平板倒置前保证稀释液被完全吸收，这种划区域的平板培养法是一种方便、有效的方法。
图表6快速计数方法
用传统方法或快速方法来鉴别分离物，用图表6的方法来计数。当所有的李斯特氏菌被计数，并且，要估计单增李斯特氏菌的数目时，就要依据十种典型的李斯特氏菌来确定其种类。详细资料参考Anthony Hitchins@cfsan.fda.gov。Grant发明了一种精确的计数方法，利用BAM李斯特氏菌增菌与分离方法进行计数，这种方法必须满足李斯特氏菌的数目100cfu/g。
差额计数：在2*25g食品或饮料中，按现在的“零差额政策”，没有检出单增李斯特氏菌，因此，决定菌数差额是否在允许范围内的计数是不需要的。差额计数需要高准确度，而不需监视计数。通过计算菌落数来进行高准确度的差额计数以及监视计数。目前的FDA方法，将一个平板划分为一个区域或者是多于96个区域，用移液器加入0.1mlBLEB和样品的混合液，30℃培养48h，同监视计数一样，将增菌过的液体接种到ALOA、BCM或相应培养基上，来检测阳性菌。根据单增李斯特氏菌在总的李斯特氏菌中的比例，运用Poisson等式可计算出平均浓度。
运用MPN方法中的可预测出单增李斯特氏菌的数目。
鉴定分离物有两种方法：传统方法（使用ALOA、BCM或相应的培养基）和快速方法。需要时，要估计每10个李斯特氏菌所含单增李斯特氏菌的比例。
伴随检测的计数：大多数样品可能是阴性的，因而，需要先进行检测，然后再进行计数。尽管大多数呈现阳性的样品只含有极少几个cfu李斯特氏菌/25g样品中，但是，同时进行检测计数，有时可能会更方便一些。准备增菌液（如前所述方法）进行增菌，取0.1ml涂布于ALOA、BCM或其他相应的单增李斯特氏菌选择性培养基上，35℃培养24-48h，使平板上单增李斯特氏菌的数量分为几类：0.04cfu/g、0.04-100cfu/g、100-25000cfu/g和大于25000cfu/g。重复几次实验可用来准确计数。选取5个单菌落可用传统的糖发酵方法来检测是否发酵L-鼠李糖，也可利用BCM鼠李糖鉴定培养基或单增李斯特氏菌鉴定试剂盒来确定食品中不常见的绵羊李斯特氏菌。

参 考 文 献
1. AOAC Official Method 992.18. 2000. MICRO-ID Listeria. Chapter 17.10.02, pp. 141-144 In: Official Methods of Analysis of AOAC INTERNATIONAL. 17th Edition. W. Horwitz (ed.). Volume 1. Agricultural Chemicals, Contaminants and Drugs. AOAC INTERNATIONAL, Gaithersburg, MD.
2. AOAC Official Method 992.19. 2000. Vitek GPI and GNI+. Chapter 17.10.03, pp. 144-147 In: Official Methods of Analysis of AOAC INTERNATIONAL. 17th Edition. W. Horwitz (ed.). Volume 1. Agricultural Chemicals, Contaminants and Drugs. AOAC INTERNATIONAL, Gaithersburg, MD.
3. AOAC Official Method 993.09. 2000. Listeria in dairy products, seafoods, and meats. Colorimetric deoxyribonucleic acid hybridization method  (GENE-TRAK Listeria Assay). Chapter 17.10.04, pp. 147-150 In: Official Methods of Analysis of AOAC INTERNATIONAL. 17th Edition. W. Horwitz (ed.). Volume 1. Agricultural Chemicals, Contaminants and Drugs. AOAC INTERNATIONAL, Gaithersburg, MD.
4. AOAC Official Method 993.12. 2000. Listeria monocytogenes in Milk and Dairy Products, Selective Enrichment and Isolation Method (IDF Method). Chapter 17.10.01, pp. 138-139 In: Official Methods of Analysis of AOAC INTERNATIONAL. 17th Edition. W. Horwitz (ed.). Volume 1. Agricultural Chemicals, Contaminants and Drugs. AOAC INTERNATIONAL, Gaithersburg, MD.
5. AOAC Official Method 994.03. 2000. Listeria monocytogenes in dairy products, seafoods, and meats. Colorimetric monoclonal enzyme-linked immunosorbent assay method (Listeria -Tek). Chapter 17.10.05, pp. 150-152 In: Official Methods of Analysis of AOAC INTERNATIONAL. 17th Edition. W. Horwitz (ed.). Volume 1. Agricultural Chemicals, Contaminants and Drugs. AOAC INTERNATIONAL, Gaithersburg, MD.
6. AOAC Official Method 995.22. 2000. Listeria in foods. Colorimetric polyclonal enzyme immunoassay screening method (TECRA Listeria Visual Immunoassay [TLVIA]). Chapter 17.10.06, pp. 152-155 In: Official Methods of Analysis of AOAC INTERNATIONAL. 17th Edition. W. Horwitz (ed.). Volume 1. Agricultural Chemicals, Contaminants and Drugs. AOAC INTERNATIONAL, Gaithersburg, MD.
7. AOAC Official Method 996.14. 2000. Assurance Polyclonal Enzyme Immunoassay Method. Chapter 17.10.07, pp. 155-158 In: Official Methods of Analysis of AOAC INTERNATIONAL. 17th Edition. W. Horwitz (ed.). Volume 1. Agricultural Chemicals, Contaminants and Drugs. AOAC INTERNATIONAL, Gaithersburg, MD.