中华人民共和国进出口商品检验行业标准
　　　出口食品副溶血性弧菌检验方法 SN 0173—92 代替ZB X04 002—86
Method for detection of Vibrio parahaemolyticus in food for export

 



1　主题内容与适用范围
　　本标准规定了海产食品中副溶血性弧菌检验方法。
本标准适用于海产食品中副溶血性弧菌检验,其他食品可参照使用。
2　设备与材料
2.1 试管:17mm×170mm、15mm×150mm、10mm×100mm。
2.2 吸管:1mL、10mL。
2.3　培养皿:直径90mm。 
2.4　广口瓶或三角瓶。
2.5　电动均质器。
2.6　电动试管振荡器。
2.7 37℃恒温箱。
2.8 42℃恒温水浴箱。
2.9　试管架。
3　培养基及试剂 
3.1 30g/L氯化钠稀释液:见9.1。
3.2 60g/L氯化钠蛋白胨水(PW):见9.2。
3.3　氯化钠多粘菌素B肉汤(SPB):见9.3。 
3.4　硫代硫酸钠、柠檬酸钠、胆盐、蔗糖琼脂(TCBS):见9.4。
3.5　氯化钠三糖铁琼脂(TSI):见9.5。 
3.6　嗜盐性试验用胰胨水(TB):见9.6。
3.7　胰胨大豆琼脂斜面(TSA):见9.7。
3.8　靛基质试验用培养基(I):见9.8。 
3.9　氨基酸试验用培养基:见9.9。
3.10 V-P半固体琼脂(VP):见9.10。
3.11 糖类分解试验用培养基:见9.11。 
3.12　42℃生长试验用培养基:见9.12。
3.13　O/F试验用培养基(HLGB):见9.13。
3.14  神奈川现象试验用我妻氏琼脂(WA):见9.14。
4　样品制备
4.1　冷冻样品应在45℃以下不超过15min或在2～5℃不超过18 h解冻。若不能及时检验, 
应放于—15℃左右保存；非冷冻而易腐的样品应尽可能及时检验,若不能及时检验,应置于6～10℃冰箱保存,在24 h内检验。
4.2　取样:以无菌操作进行。 
4.2.1 鱼类:取鱼体不同部位。 
4.2.2　贝类:取内脏或含内脏的全部贝肉；如为带壳贝类,则应先在清洁的流水中洗刷净外壳,然后以无菌操作打开贝壳,取出内脏或含内脏的全部贝肉和贝液。 
4.2.3　甲壳类:取包括鳃及肠的部分或整体。
4.3　以无菌操作称取50 g检样放于均质杯中,以灭菌剪刀充分剪碎。
4.4　加30  g/L氯化钠稀释水450mL,均质(8 000  r/min)1min,使成1:10稀释液(如无均质器,则应以剪刀尽量剪碎,加450mL稀释水使成1:10稀释液,并充分振荡)。 
4.5　用1mL灭菌吸管吸取1:10稀释液1mL,注入装有9mL30 g/L氯化钠稀释水的试管内,振摇试管混合均匀,制成1:100稀释液。 
4.6　每一稀释度换取1支1 mL灭菌吸管,按上项操作顺序进行10倍递增稀释。稀释倍数要依据有关标准、规定、要求或样品污染情况而定。
5　增菌培养和分离 
5.1　对新鲜样品,可选择3个连续适宜的稀释度,分别以1mL无菌吸管各吸取1mL稀释液,  接种10mL单料氯化钠多粘菌素B肉汤中,进行选择性增菌培养,每一稀释度接种3 管(若选择的稀释度为接种1g样品时,则应以10mL灭菌吸管吸取1:10稀释液10  mL,接种10 mL双料氯化钠多粘菌素B肉汤中)。对经加热、辐射处理或冷藏、冻结的样品,可按以上操作先将样品接种于60  g/L氯化钠蛋白胨水于37℃前增菌18～24h,然后将培养物以接种环转种到氯化钠多粘菌素B肉汤中进行选择性增菌。
5.2 37℃培养18～24 h。 
5.3　氯化钠多粘菌素B肉汤管如有菌生长,则以3 mm直径接种环分别取一环菌液,划线于硫代硫酸钠、柠檬酸钠、胆盐、蔗糖琼脂(TCBS)平板上。
5.4  37℃培养18～24 h。 
5.5　副溶血性弧菌在蔗糖琼脂(TCBS)平板上的典型菌落呈圆形,边缘整齐、湿润、稍混浊、半透明,多数具尖心、斗笠状,蓝绿色菌落,直径2～4mm。
6　生化鉴定 
6.1　在蔗糖琼脂(TCBS)平板上如出现典型或可疑菌落,每个平板至少挑取两个菌落,每个菌落分别顺次接种到下列培养基进行鉴别试验。
6.1.1　无盐胰胨水。 
6.1.2 30g/L氯化钠胰胨水。
6.1.3　氯化钠三糖铁琼脂:先穿刺后划线。
6.2 37℃培养18～24 h。 
6.3　选取在氯化钠三糖铁斜面上产碱,在底层产酸,不产气,不产硫化氢；在无盐胰胨水中几乎不生长,在30  g/L氯化钠胰胨水中生长旺盛的菌株进行革兰氏染色、镜检,副溶血性弧菌为革兰氏阴性,呈棒状、弧状、卵圆状等多形态,两端浓染、无芽胞。如符合,  继续进行以下生化鉴定。
6.3.1　嗜盐性试验:各取一环30g/L氯化钠胰胨水培养物,分别接种到70g/L及100g/L氯化钠胰胨水中,37℃培养18～24  h。
6.3.2　细胞色素氧化酶试验:取一环30g/L氯化钠胰胨水培养物划线到胰胨大豆琼脂斜面上,37℃培养18～24 h。 
6.3.3　靛基质试验:在6.1.2的30 g/L氯化钠胰胨水培养物中加靛基质试剂后观察反应。 
6.3.4　赖氨酸脱羧酶试验:由氯化钠三糖铁斜面以接种针取少许培养物接种到赖氨酸试验用培养基中,37℃培养18～24 h。 
6.3.5　精氨酸双水解酶试验:按上项同样操作,将培养物接种到精氨酸试验用培养基中, 37℃培养18～24h。
6.3.6  V-P试验:以接种针由氯化钠三糖铁斜面取少许培养物穿刺V-P半固体琼脂,37℃培养18～24h。在加V-P试剂前应先观察动力。沿穿刺线周围呈扩散性生长为动力阳性。 
6.4　副溶血性弧菌生化特性的判定及进一步试验如下。
6.4.1　如所分离的菌株符合表1特性,按第7章报告结果。 
　表1　副溶血性弧菌的生化特性

　　　　　　　
6.4.2如表1生化项目(扩大生化试验项目除外)中,仅有一项生化试验不符合时,按以下步骤做进一步鉴定
6.4.2.1　蔗糖分解试验,42℃生长试验,O/F试验。如仍符合副溶血性弧菌特性,可按第 7章报告结果,如其中有一项不符合,即可排除。 
6.4.2.2　副溶血性弧菌与有关细菌的鉴别可参考表2进行。 　　　　　　
表2　副溶血性弧菌与有关细菌鉴别表 

注:空白处表示未试验；ｖ表示可变的。
7　报告结果
　　生化试验符合副溶血性弧菌特性的菌株,按增菌培养阳性管数,应用表3(3管法),查出每100 
g样品中的副溶血性弧菌MPN值。检验结果报告为每100g样品中副溶血性弧菌的最近似值为××个。　　　　　　　　　　表3　每克样品中的最近似值(3管法MPN) 
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阳 性 管 数　　　 ┃　　　　┃　　　阳 性 管 数　 ┃
━━━━━━━━━┫　MPN 　┣━━━━━━━━━━┫ MPN
0.1 0.01 0.001　 ┃　　　　｜ 0.1 0.01 0.001　　┃
━━━━━━━━━╋━━━━╋━━━━━━━━━━╋━━━━
0　 0　 0　　　 ┃ ＜3 　┃　 2　 0　 0　　　　┃ 9.1
0　 0　 1　　　 ┃　 3　 ┃　 2　 0　 1　　　　┃ 14
0 　0　 2　　　 ┃ 　6　 ┃　 2　 0　 2　　　　┃ 20 
0 　0　 3　　　 ┃　 9　 ┃　 2　 0　 3　　　　┃ 26 
0　 1　 0　　　 ┃　 3　 ┃ 　2　 1　 0　　　　┃ 15 
0　 1　 1　　　 ┃ 　6.1 ┃　 2　 1　 1　　　　┃ 20 
0 　1　 2　　　 ┃　 9.2 ┃ 　2　 1　 2　　　　┃ 27 
0　 1　 3　　　 ┃　　12 ┃　 2　 1　 3　　　　┃ 34 
0　 2　 0　　　 ┃　 6.2 ┃ 　2　 2　 0　　　　┃ 21 
0　 2　 1 　　　┃ 　9.3 ┃　 2　 2　 1　　　　┃ 28 
0　 2　 2　　　 ┃　 12　┃　 2　 2　 2　　　　┃ 35 
0　 2　 3　　　 ┃ 　16　┃ 　2　 2　 3　　　　┃ 42 
0　 3　 0　　　 ┃　 9.4 ┃　 2　 3　 0　　　　┃ 29
0　 3　 1　　　 ┃　 13　┃　 2　 3　 1　　　　┃ 36 
0　 3　 2　　　 ┃　 16　┃ 　2　 3　 2　　　　┃ 44 
0　 3　 3　　　 ┃　 19　┃　 2　 3　 3　　　　┃ 53 
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1　 0　 0　　　 ┃　 3.6 ┃ 　3　 0　 0 　　 　┃ 23
1　 0　 1　　　 ┃ 　7.2 ┃　 3　 0　 1　　　　┃ 39
1　 0　 2　　　 ┃ 　11　┃　 3　 0　 2　　　　┃ 64
1　 0　 3　　　 ┃　 15　┃　 3　 0　 3　　　　┃ 95
1　 1　 0　　　 ┃ 　7.3 ┃ 　3　 1　 0　　　　┃ 43
1　 1　 1　　　 ┃　 11　┃ 　3　 1　 1　　　　┃ 75
1　 1　 2　　　 ┃ 　15　┃ 　3　 1　 2　　　　┃ 120
1　 1　 3　　　 ┃　 19　┃ 　3　 1　 3　　　　┃ 160
1　 2　 0　　　 ┃　 11　┃ 　3　 2　 0　　　　┃ 93
1　 2　 1　　　 ┃　 15　┃　 3　 2　 1　　　　┃ 150
1　 2　 2　　　 ┃ 　20　┃ 　3　 2　 2　　　　┃ 210
1　 2　 3　　　 ┃　 24　┃ 　3 　2　 3　　　　┃ 290
1　 3　 0　　　 ┃　 16　┃ 　3　 3　 0　　　　┃ 240
1　 3　 1 　　　┃ 　20　┃ 　3　 3　 1　　　　┃ 460
1　 3　 2　　　 ┃ 　24　┃　 3　 3　 2　　　　┃ 1100
1　 3　 3　　　 ┃ 　29　┃ 　3　 3　 3　　　　┃＞1100
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