中华人民共和国进出口商品检验行业标准
出口食品中蜡样芽孢杆菌检验方法 SN 0176—92
Method for detection of bacillus cereus in food for export
1 主题内容与适用范围
本标准规定了出口食品中蜡样芽孢杆菌的检验方法。
本标准适用于出口食品的检验。
2 设备和材料
2.1 吸管：容量1.0mL和10.0mL,具0.1mL刻度。
2.2 菌落计数器。
2.3 均质器。
2.4 厌氧培养装置。
2.5 涡动搅拌器。
2.6 L形玻璃棒。
2.7 恒温培养箱: 30℃及36±1℃。
3 培养基和试剂
3.1 甘露醇卵黄多粘菌素琼脂(MYP)。
3.2 胰酪胨大豆多粘菌素肉汤。
3.3 酚红葡萄糖肉汤。
3.4 硝酸盐肉汤。
3.5 营养琼脂。
3.6 L-酪氨酸营养琼脂。
3.7 溶菌酶营养肉汤。
3.8 改良V-P培养基。
3.9 动力培养基。
3.10 胰酪胨大豆羊血琼脂(TSSB)。
3.11 Butterfield氏磷酸盐缓冲稀释液。
3.12 亚硝酸盐试剂。
3.13 V-P试剂。
3.14 碱性复红染色液。
4 样品的保存和送检
待检样品应保持在6℃以下运送并尽可能不使其冷冻。送达实验室后,应保存于4℃并尽快进行检验。如在4d内不能进行检验,应将样品储存在-20℃,检验前再于室温下解冻。脱水食品可在常温下送检和储存。
5 样品的制备
5.1 以无菌操作用灭菌刀、剪将样品剪碎。称取50 g放于无菌均质杯中。
5.2 加450 mL无菌磷酸盐缓冲稀释液于均质杯中以18000～20000 r/min均质2min。制成1 : 10样品稀释液。
5.3 取1: 10稀释液10.0 mL加到含有90.0 mL无菌磷酸盐缓冲液的稀释瓶中,充分混匀制成1 : 100的稀释液。
5.4 每个稀释度换用1支10.0mL灭菌吸管,按上述操作程序进行10倍递增稀释直至10**-6。
6 检验步骤
6.1 平板计数法
6.1.1 取各稀释液0.1mL接种到MYP琼脂平板上。用灭菌L形玻璃棒均匀涂布于整个琼脂表面。每稀释度接种两个MYP琼脂平板。
6.1.2 将平板置于30℃培养24 h。
6.1.3 选取具有15～150个典型或可疑蜡样芽孢杆菌菌落的平板,进行计数。并计算同一稀释度两个平板的平均菌落数。
蜡样芽孢杆菌在MYP琼脂平板上生成的菌落为微粉红色,环绕产生卵磷脂酶沉淀环。如反应不典型,可继续培养24h再计数。
6.1.4 计数后,从每个平板至少选取5个已计数的菌落分别接种于营养琼脂斜面,于30℃培养24 h,按第6章进行证实试验。
6.1.5 根据证实试验确定为蜡样芽孢杆菌的菌落数,按比例计算出该皿内的蜡样芽孢杆菌菌落数,然后乘其稀释倍数再乘以10,即得每克样品所含蜡样芽孢杆菌数并作出报告。
例:将检样10**-4稀释液0.1mL涂布于MYP琼脂平板上,生成的可疑菌落数为25个,取5个进行鉴定,证实为蜡样芽孢杆菌的是4个,则1 g样品中蜡样芽孢杆菌数为(25×4/5)×10**4×10＝2×10**6。
6.2 最近似值(MPN)法
适用于污染蜡样芽孢杆菌数不大于10**3个/g的食品。
6.2.1 选用三管法MPN系列。取10**-1、10**-2、10**-3三种稀释液,每种稀释液接种3管胰酪胨大豆多粘菌素肉汤,每管接种1mL。
6.2.2 置于30℃培养48±2 h。
6.2.3 从长菌的试管取培养物划线接种到MYP琼脂平板上。
6.2.4 置30℃培养24～48 h。
6.2.5 从MYP琼脂平板上挑取粉红色绕有沉淀环的单个菌落,接种营养琼脂斜面,置30℃培养24 h,供作证实试验。
6.2.6 根据证实试验确定为蜡样芽孢杆菌的管数,由MPN表 [附录C(补充件)]计算蜡样芽孢杆菌的MPN值/g,并作出报告。
7 证实试验
7.1 形态观察
取营养琼脂斜面培养物,作革兰氏染色镜检。蜡样芽孢杆菌为革兰氏阳性大杆菌,呈短链或长链,芽孢呈椭圆形位于菌体中央或偏端,不使菌体胀大。
7.2 生化学性状
7.2.1 葡萄糖发酵试验
接种于酚红葡萄糖肉汤中,厌氧条件下35℃培养24h。培养基应由红色变为黄色(表明本菌在厌氧条件下分解葡萄糖产酸)。
7.2.2 硝酸盐还原试验
接种于硝酸盐肉汤中,35℃培养24h。加硝酸盐试剂后应为阳性反应(红色)。
7.2.3 V-P试验
接种于改良V-P培养基中,35℃培养48 h。加V-P试剂及肌酸数粒,静止1h,应为阳性反应(伊红色)。
7.2.4 L-酪氨酸分解试验
接种于L-酪氨酸琼脂培养基上,35℃培养48 h,阳性反应菌落周围培养基应出现澄清透明区(表示产生酪蛋白酶)。阴性时应继续培养72 h再观察。
7.2.5 溶菌酶试验
用直径2mm接种环取纯菌悬液一环,接种于溶菌酶肉汤中,35℃培养24h。该菌在本培养基(含0.001％的溶菌酶)中能生长。如出现阴性反应,应继续培养24 h。
7.2.6 卵磷脂酶试验
接种于MYP琼脂平板上,35℃培养24 h。阳性反应菌落周围应出现沉淀环(表示产生卵磷脂酶)。
7.3 蜡样芽孢杆菌与类似菌的鉴别试验
7.3.1 动力试验
用接种针挑取培养物穿刺接种于动力培养基中,30℃培养24h。有动力蜡样芽孢杆菌应沿穿刺线呈扩散生长,而蕈状芽孢杆菌常常呈绒毛状生长,形成所谓的蜂巢状扩散。也可用悬滴法检查。蜡样芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌通常运动极为活泼,而炭疽杆菌则不运动。
7.3.2 根状生长试验
用接种环取培养物接种于营养琼脂平板上,30℃培养18～24h。蜡样芽孢杆菌群的多数菌株形成粗糙的似毛玻璃状或融蜡状的菌落。其中唯独蕈状芽孢杆菌则形成根状生长的特征。
7.3.3 溶血试验
取培养物接种于胰酪胨大豆羊血琼脂平板上,30～32℃培养24h。蜡样芽孢杆菌落周围呈现β型完全溶血的溶血环。苏云金芽孢杆菌和蕈状芽孢杆菌呈现弱的溶血现象,而炭疽芽孢杆菌通常为不溶血。
7.3.4 蛋白质结晶毒素试验
取经30℃培养24h并于室温放置2～3d的营养琼脂培养物少许于载玻片上,滴加蒸馏水混涂成薄膜。经自然干燥,微火固定后,于涂膜加甲醇半分钟后倾掉,再通过火焰干燥,于载片上滴满0.5％碱性复红液,放火焰上加热微见蒸气(勿使染液沸腾)后持续1.5min,移去火焰,使载片放置5min再倾去染液。用洁净自来水彻底清洗、晾干、镜检。观察
有无游离芽孢和染成黑色的菱形毒素结晶体。如发现游离芽孢形成的不丰富,应将培养
物置室温2～3d再行检查。苏云金芽孢杆菌用此法检测为阳性,而蜡样芽孢杆菌群的其他菌种则为阴性。
7.3.5 结果解释及报告
符合蜡样芽孢杆菌群的特征,有活泼的动力,很强的溶血能力,不形成根状生长和不产生蛋白结晶毒素,可报告为蜡样芽孢杆菌。
对偶尔遇到的一些少数可疑菌株,可以根据需要进行其他试验,如青霉素酶、噬菌体试验等。
