中华人民共和国进出口商品检验行业标准
出口食品小肠结肠炎耶尔森 SN 0174—92
Method for detection of Yersinia
enterocciitica in food for export
1 主题内容与适用范围
本标准规定了出口冷冻和生鲜的猪肉、猪舌、鸡肉、虾和虾仁中小肠结肠炎耶尔森氏菌(以下简称耶氏菌)检验方法。
本标准适用于出口冷冻和生鲜的猪肉、猪舌、鸡肉、虾和虾仁中耶氏菌检验。其他食品可参照使用。
2 样品制备及增菌培养
2.1 如为冷冻食品,应于2～5℃下不超过18h解冻。若不能及时检验,应放于—15℃保存,最多不能超过2 d。非冷冻易腐的食品应置于4℃冰箱保存,最多不得超过3d。
2.2 无菌操作称取剪碎后的样品25g(猪舌应剪取舌根、舌两侧及舌尖部肉),置于装有225mL改良的磷酸盐缓冲液的500mL广口玻璃瓶中,充分振荡(若采用均质,可将剪碎后的样品25g置于灭菌均质杯内,加入25mL已灭菌的改良磷酸盐缓冲液,以8000～10000r/min均质0.5min,再将均质好的样品置入装有200mL改良的磷酸盐缓冲液的500mL广口玻璃瓶中,充分振荡),然后于25℃培养48±2h。吸取该培养液1mL移种于预先预热到25℃的装有
9mL的5g/L氢氧化钾溶液的试管中,使之充分混合0.5min。立即吸取该混合液2mL移种于预先预热到25℃的装有8 mL的改良的酵母浸汁-孟加拉红肉汤的试管中,充分混合,于25℃培养4～6h。
3 分离培养
3.1 将上述经改良的酵母浸汁-孟加拉红肉汤增菌的培养液摇匀,以直径3mm的接种环分别挑取一环划线于表面无凝固水的含吐温80的亚硫酸铋琼脂平板和含吐温80的麦康凯琼脂平板各一个,培养于25℃,含吐温80的亚硫酸铋琼脂平板培养3～4d,含吐温80的麦康凯琼脂平板培养48±2h。
3.2 观察各琼脂平板,有无典型或可疑耶氏菌菌落。
耶氏菌的菌落特征见表1：
表1 小肠结肠炎耶尔森氏菌菌落特征
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琼脂┃菌落┃ 菌 落 特 征
平板┃类别┣━━━━┳━━━━┳━━━┳━━━━━┳━━━━━━┳━━━┳━━
┃ ┃大小,mm ┃表 面┃透明度┃ 高 度 ┃ 颜 色 ┃边 缘┃形状
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┃ ┃1～1.5 ┃粗糙, 有┃ ┃枕状,中心 ┃淡粉红色, 菌┃ ┃
┃ A ┃ ┃多层环状┃不透明┃呈乳头状凸┃落周围绕有毛┃不整齐┃圆形
┃ ┃ ┃皱折 ┃ ┃起 ┃玻璃样淡粉红┃ ┃
┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃色晕 ┃ ┃
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含吐┃ ┃1～1.5 ┃光滑、湿┃半透明┃ 扁 平 ┃淡粉红色, 菌┃ ┃
温80┃ B ┃ ┃润 ┃ ┃ ┃落周围绕有毛┃整 齐┃圆形
的麦┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃玻璃样淡粉红┃ ┃
康凯┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃色晕 ┃ ┃
琼脂┣━━╋━━━━╋━━━━╋━━━╋━━━━━╋━━━━━━╋━━━╋━━
┃ ┃1～3.0 ┃光滑、湿┃半透明┃ 扁 平 ┃淡橙粉红色 ┃有细微┃
┃ C ┃ ┃润 ┃ ┃ ┃ ┃散射状┃圆形
┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃皱折 ┃
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┃ ┃1～1.5 ┃粗糙, 有┃ ┃枕状、中心┃淡粉红色, 菌┃ ┃
┃ D ┃ ┃多层环状┃不透明┃呈乳头状凸┃落周围培养基┃不整齐┃圆形
┃ ┃ ┃皱折 ┃ ┃起 ┃为透明淡蔷薇┃ ┃
┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃红色 ┃ ┃
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┃ ┃针尖～ ┃ ┃ ┃ ┃黑绿色或黑灰┃ ┃
┃ ┃ 3.0┃ ┃ ┃ ┃色至漆黑色, ┃ ┃
含吐┃ E ┃ ┃ 光 滑 ┃不透明┃扁平或凸起┃菌落周围培养┃整 齐┃圆形
温80┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃基有时有黑绿┃ ┃
的亚┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃色微粒弥漫 ┃ ┃
硫酸┣━━╋━━━━╋━━━━╋━━━╋━━━━━╋━━━━━━╋━━━╋━━
铋琼┃ ┃2～3 ┃粗糙, 有┃ ┃扁平, 有时┃灰绿色, 菌落┃ ┃
脂 ┃ F ┃ ┃多层环状┃不透明┃中心呈乳头┃周围绕有浅灰┃不整齐┃圆形
┃ ┃ ┃皱折 ┃ ┃状凸起 ┃绿色或蓝绿色┃ ┃
┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃毛玻璃样晕 ┃ ┃
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4 鉴定
4.1 筛选试验
4.1.1 每种琼脂平板至少应挑取两个典型或可疑菌落,分别用光滑的接种针穿刺并密布地接种于改良的克氏双糖铁琼脂各一管,于25℃培养24±2h。
4.1.2 挑取菌落后的琼脂平板,应置于5～8℃至少保留24 h,以备必要时复查。
4.1.3 按表2试验结果进行判断。
表2 改良的克氏双糖铁琼脂筛选小肠结肠炎耶尔森氏菌
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改良的克氏双糖铁琼脂 ┃
━━━━━┳━━━━━┳━━━━━┳━━━━━┫ 初步判断
斜 面 ┃ 底 层 ┃ 产 气 ┃ 硫化氢 ┃
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A ┃ A ┃ －(＋) ┃ － ┃ 可疑小肠结肠炎耶尔森氏菌
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A ┃ A ┃ ＋ ┃ ＋ ┃
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A ┃ A ┃ ＋ ┃ － ┃
━━━━━╋━━━━━╋━━━━━╋━━━━━┫ 非小肠结肠炎耶尔森氏菌
K ┃ A ┃ ＋ ┃ ＋ ┃
━━━━━╋━━━━━╋━━━━━╋━━━━━┫
K ┃ A ┃ － ┃ － ┃
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注：K产碱,A产酸；＋阳性反应；－阴性反应；(＋)偶见少量小气泡。
4.2 生化试验
4.2.1 刮取一满环(直径3mm)符合表 2的典型或可疑耶氏菌特性的改良克氏双糖铁琼脂斜面培养物,接种于装有1mL Rustigian氏尿素培养基(改良法)的10 mm×100 mm的试管中,手摇或于电动快速混合器上振摇5～6s,然后于25℃培养,每隔半小时观察一次,培养观察至4h。
4.2.2 将尿素酶试验阳性的改良克氏双糖铁琼脂斜面培养物按表3所列生化项目(尿素酶试验除外)进行生化试验,培养于25℃,氨基酸脱羧酶试验培养24～30h,其他生化试验阴性结果的应培养观察4d。
表3 小肠结肠炎耶尔森氏菌生化反应与血清学试验结果判定
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生 化 反 应 ┃ ┃
━━━┳━━━┳━━━┳━━┳━━━┳━━━┳━━┳━━━┫ ┃结 果
尿素酶┃鸟氨酸┃赖氨酸┃蔗糖┃山梨醇┃L-阿拉┃鼠李┃西蒙氏┃血清学试验┃判 定
试验 ┃脱羧酶┃脱羧酶┃试验┃ 试验 ┃伯糖试┃糖试┃枸橼酸┃ ┃
┃ 试验 ┃ 试验 ┃ ┃ ┃验 ┃ 验 ┃盐试验┃ ┃
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┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃"O"因子血 ┃小肠结
┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃清试验阳性┃肠炎耶
＋ ┃ ＋ ┃ － ┃ ＋ ┃ ＋ ┃ ＋ ┃ － ┃ － ┃ ┃尔森氏
┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃菌( 典
┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃型 )
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＋ ┃ ＋ ┃ － ┃ － ┃ ＋ ┃ ＋ ┃ － ┃ － ┃"O"因子血 ┃
┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃清试验阳性┃
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＋ ┃ － ┃ － ┃ － ┃ － ┃ ＋ ┃ － ┃ － ┃"O"因子血 ┃
┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃清试验阳性┃小肠结
━━━╋━━━╋━━━╋━━╋━━━╋━━━╋━━╋━━━╋━━━━━┫肠炎耶
＋ ┃ ＋ ┃ － ┃ ＋ ┃ ＋ ┃ ＋ ┃ ＋ ┃ ＋ ┃"O"因子血 ┃尔森氏
┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃清试验阳性┃菌(非
━━━╋━━━╋━━━╋━━╋━━━╋━━━╋━━╋━━━╋━━━━━┫典型)
＋ ┃ ＋ ┃ － ┃ ＋ ┃ ＋ ┃ ＋ ┃ ＋ ┃ － ┃"O"因子血 ┃
┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃清试验阳性┃
━━━╋━━━╋━━━╋━━╋━━━╋━━━╋━━╋━━━╋━━━━━┫
＋ ┃ ＋ ┃ － ┃ ＋ ┃ ＋ ┃ ＋ ┃ － ┃ ＋ ┃"O"因子血 ┃
┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃清试验阳性┃
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注：＋阳性反应；－阴性反应。
4.2.3 观察生化反应结果,将符合表3耶氏菌特性的,按4.3进行血清学试验；如不符合表3 所列生化反应,特别是尿素酶试验阴性或赖氨酸脱羧酶试验阳性为非小肠结肠炎耶尔森氏菌。
4.3 血清学试验
在洁净的载玻片上加一滴“O”因子血清,将待试培养物混入其内,使成为均一性混浊悬液,将玻片轻轻摇动0.5～1 min,在黑色背景下观察反应。如在2min内出现比较明显的小颗粒状凝集者,即为阳性反应,反之则为阴性,另用生理盐水作对照试验,以检查有无
自凝现象。
4.4 根据4.2和4.3试验结果,按照表3进行判定。
如生化反应结果完全符合表3耶氏菌特性,但与所有“O”因子血清均不发生凝集反应者,其菌落典型,镜检为革兰氏阴性、无芽胞小短杆菌,可按《Bergey氏细菌学鉴定手册》最新版扩大必要的生化试验,判定为可疑小肠结肠炎耶尔森氏菌,并送交上一级单位鉴定。
5 报告结果
5.1 报告阳性结果:“检出小肠结肠炎耶尔森氏菌”。
5.2 报告阴性结果:“未检出小肠结肠炎耶尔森氏菌”。
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