出口食品平板菌落计数
中华人民共和国进出口商品检验行业标准
SN 0168-92 代替 ZB X09 001-86
Plate count for bacterial colonies in food for export
1 主题内容与适用范围
本标准规定了出口食品平板菌落计数的方法。
本标准适用于各种出口食品及其原料 , 有专门规定检验方法的除外。
2 设备和材料
2.1 工作台：超净工作台或放于清洁、光线充足的实验室里的水平工作台。琼脂平板在工作台上暴露 15 min, 每平板不得超过 15 个菌落。
2.2 恒温培养箱： 36 ± 1 ℃ 。
2.3 恒温水浴箱： 45 ± 1 ℃ 。
2.4 均质器。
2.5 振荡器。
2.6 吸管： 1 、 10 和 25mL, 具 0.1mL 刻度。
2.7 平皿：直径为 90 mm 。
2.8 稀释瓶：广口瓶或三角烧瓶 , 容量为 200 mL 和 500 mL 。
2.9 玻璃珠：直径为 5mm 左右。
2.10 天平：感量 0.1g 。
3 培养基和试剂
3.1 平板计数琼脂。
3.2 75 ％乙醇。
3.3 稀释剂：磷酸盐缓冲稀释液。
4 操作程序
4.1 样品制备
4.1.1 以无菌操作取有代表性的样 品盛于灭菌容器内 , 如有包装 , 则用 75 ％乙醇在包装开口处擦拭后取样。
4.1.2 制备样品匀液
4.1.2.1 固体或半固体食品：以无菌操作取 25 g 样品 , 放入装有 225mL 稀释剂的灭菌均质杯内 , 于 8000r/min 均质 1 ～ 2min, 制成 1:10 的样品匀液。如样品均质时间超过 2min, 应在均质杯外加冰水冷却。
4.1.2.2 干燥或干粉食品：以无菌操作取 25 g 样品 , 放入装有 225mL 稀释剂和适量玻璃珠的 500 mL 稀释瓶中。迅速振摇 , 将样品混匀 , 制成 1 : 10 的样品匀液。振摇时 , 幅度为 30cm ,7s 内振摇 25 次 , 也可用机械振荡器振荡 15s 代替手摇。
4.1.2.3 液体食品 : 用灭菌吸管吸取 25mL 样品 , 放入装有 225mL 稀释剂的 500mL 稀释瓶中 , 按 4.1.2.2 条中所述方法迅速振摇 , 制成 1:10 的样品匀液。吸取样品时 , 吸管插入液面下不要超过 2.5cm 。吸管内液体要在 2 ～ 4s 内完全排入稀释剂中。不要在稀释剂中吹洗吸管。
4.2 稀释样品匀液
4.2.1 用 10 mL 灭菌吸管准确吸取 1:10 的样品匀液 10 mL, 放入装有 90 mL 稀释剂的 200mL, 稀释瓶中。按 4.1.2.2 条中所述的方法 , 迅速振摇。制成 1:100 的样品液。从容器中吸取样品匀液和以后的稀释操作中 , 吸管尖不要碰着瓶口。吸入的液体应先高于所要求的刻度 , 然后提起吸管使其尖端离开液面并贴在容器内壁将液体调至所要求的刻度。
4.2.2 分别用 10mL 灭菌吸管按 4.2.1 条所述方法将样品匀液制成 10 倍递增稀释的样品液 , 如 10**-3 、 10**-4 、 10**-5 ……。
4.3 平板接种
4.3.1 对于每一个样品 , 选用合适的三个连续稀释度的样品液进行平板计数。
4.3.2 分别用灭菌吸管吸取 1mL 样品液放入作了适宜标志的平皿内。每个稀释度的样品液用两个平皿。如果某一样品液在取出供试部分前的放置时间超过 3 min, 应按 4.1.2.2 条所述方法再振摇该样品液。
4.3.3 分别加 12 ～ 15mL 平板计数琼脂 ( 已放 45 ＋ 1 ℃ 的水浴中恒温 ) 到各平皿内。立即将平皿内的样品液和琼脂培养基充分混合。混合方法是将平皿倾斜和旋转。要防止把混合物溅到平皿壁和盖上。同时将平板计数琼脂倾入加有 1 mL 稀释剂的另一灭菌平皿作空白对照。将样品液加入平皿后应立即倾注琼脂培养基 , 每个样品从开始稀释到倾注最后一个平皿所用的时间不得超过 20min 。
4.4 培养 待琼脂凝固后将平皿翻转 , 立即放进 36 ± 1 ℃ 的恒温培养箱内培养 48 ± 2h 。培养箱应 保持一定的湿度 , 经 48h 培养的琼脂培养基的失重不得超过 15 ％。
4.5 菌落计数和记录
4.5.1 培养后 , 立即计数每个平板上的菌落数。 25 ～ 250 个菌落为合适范围。如果不能立即计数 , 应将平板存放于 0 ～ 4 ℃ , 但不得超过 24 h 。
4.5.2 如只有一个稀释度的两个平板上的菌落在合适范围内 , 先计算两个平板的平均值 , 再将平均值乘以相应稀释倍数 , 作为每克 ( 毫升 ) 样品中平板菌落数 ( 下表 , 样品 1) 。
4.5.3 如有两个稀释度在合适范围内 , 先计算每个稀释度两个平板的平均值 , 再计算两个稀释度的平均值 , 然后计算每克 ( 毫升 ) 样品中平板菌落数 ( 下表 , 样品 2) 。
4.5.4 当最低稀释度的两个平板上都少于 25 个菌落时 , 计数这一稀释度两个平板上的实际菌落数 , 计算两个平板上的平均菌落数 , 将平均菌落数乘以稀释倍数 , 得到估计的平板菌落数。给这个数注上星号 (*), 表明该数系从菌落数在 25 ～ 250 这一范围之外的平板估计所得 ( 下表 , 样品 3) 。
4.5.5 当所有平板上的菌落都超过 250 时 , 则应将最高稀释度的两个平板的平均菌落数乘以稀释倍数 , 得到估计的平板菌落数。给这个数注上星号 (*) ( 意义同 4.5.4)( 下表 , 样 品 4) 。
4.5.6 如果所有稀释度的平板都没有菌落 , 则以小于 1 乘以最低稀释倍数报告平板菌落数。给这个数注上星号 (*) ( 意义同 4.5.4 条 ) ( 下表 , 样品 5) 。
4.5.7 同一稀释度的两个平板中 , 一个有 25 ～ 250 个菌落 , 另一个的菌落多于 250 个 , 两个平板都要计数。计算方法同 4.5.2 条 ( 下表 , 样品 6) 。
4.5.8 两个连续稀释度中的每个稀释度都有一个平板的菌落数在 25 ～ 250 个范围内 , 而另一个的菌落数高于 250 或低于 25, 四个平板都要计数。计算方法参照 4.5.2 条和 4.5.3 条 ( 下表 , 样品 7) 。
4.5.9 某稀释度的两个平板都有 25 ～ 250 个菌落 , 而另一稀释度的两个平板中只有一个平板的菌落数在 25 ～ 250 范围内。四个平板都要计数 , 计算方法参照 4.5.2 条和 4.5.3 条 ( 下表 , 样品 8 、 9) 。
4.5.10 蔓延生长菌落 通常有三种不同类型的蔓延生长菌落。第一种类型是链状菌落 , 菌落之间没有明显界线 , 这些菌落是当琼脂和试验物混合时 , 一个细菌块被分散所致；第二种类型是在琼脂和 平皿底之间形成的水膜样菌落；第三种是在平皿边缘或琼脂表面形成的水膜样菌落。如果所选择的平板出现过量的蔓延菌落生长 , 以致 a. 被蔓延菌落盖住的地方 , 包括由于蔓延菌落造成的抑制生长区面积超过平板面积的 50 ％ , 或 b. 由于蔓延菌落造成的抑制生长区面积超过平板面积的 25 ％ , 这样的平板报告为“蔓延菌落” , 不予计数。计数其他平板上的菌落数 , 将这些数值的算术平均值报告为平板菌落数（下表 , 样品 10 ）。
当有必要计数除以上 a. 和 b. 外的蔓延生长菌落时 , 将三种不同类型的蔓延菌落分别计数。对于第一种类型 , 如果仅有一条链 , 将它作为一个菌落计。如果有来源不同的几条链 , 将每条链作为一个菌落计 , 不要把链上生长的各个菌落分开来数。第二种和第三种类型的蔓延生长形成易于鉴别的菌落 , 即按一般菌落计数 , 把计数的蔓延生长菌落数同一般菌落数加在一起 , 计算平板菌落数。
4.5.11 操作者对同一平板复核自己的计数结果 , 其差异应在 5 ％之内 , 而其他人对这一平板重复计数 , 其差异应在 10 ％之内。否则 , 应找出原因 , 加以校正。
4.6 计算和记录数字
适宜稀释度的两个平板的菌落数平均值或两个稀释度的平板菌落数平均值乘以相应稀释倍数计算出每克 ( 毫升 ) 样品中平板菌落数。
记录时 , 只有在换算到每克 ( 毫升 ) 样品中平板菌落数时 , 才能定下两位有效数字 , 第三位数字采用四舍五入的方法记录。也可将样品的平板菌落数记录为 10 的指数形式 ( 见下表中的例子 ) 。
5 结果报告
报告每克 ( 毫升 ) 样品中平板菌落数或估计的平板菌落数。
平板菌落数计算
样品号 |
菌 落 数 |
平板菌落数 /g(mL) |
1:100 1:1000 1:10000 |
1 |
多不可计 175 16
多不可计 208 17 |
190000(1.9 × 10**5) |
2 |
多不可计 224 25
多不可计 245 30 |
250000(2.5 × 10**5)* |
3 |
18 2 0
14 0 0 |
1600(1.6 × 10**3)* |
4 |
多不可计 多不可计 523
多不可计 多不可计 487 |
5100000(5.1 × 10**6)* |
5 |
0 0 0
0 0 0 |
＜ 100 ( ＜ 1.0 × 10**2)* |
6 |
多不可计 245 23
多不可计 278 20 |
260000(2.6 × 10**5) |
7 |
多不可计 225 21
多不可计 255 40 |
270000(2.7 × 10**5) |
8 |
多不可计 210 18
多不可计 240 28 |
230000(2.3 × 10**5) |
9 |
多不可计 260 30
多不可计 230 28 |
270000(2.7 × 10**5) |
10 |
多不可计 245 35
多不可计 230 蔓延菌落 |
290000(2.9 × 10**5) |
注 : 带星号 * 者为估计数。
附 录 A 培养基制备 ( 补充件 )
A1 平板计数琼脂
胰蛋白胨 5.0g
酵母浸膏 2.5g
葡萄糖 1.0g
琼 脂 15.0g
蒸馏水 1000mL
将各成分加于蒸馏水中 , 煮沸溶解。分装试管或烧瓶 , 121 ℃ 高压灭菌 15min 。最终 pH7.0 ± 0.1 。
A2 磷酸盐缓冲稀释液 贮存液：
磷酸二氢钾 (KH2PO4) 34.0g
蒸馏水 500mL
用大约 175 mL 的 1mol/L 氢氧化钠溶液调节 pH 至 7.2, 用蒸馏水稀释至 1000 mL 后贮存于冰箱。
稀释液：用蒸馏水稀释 1.25mL 贮存液至 1000mL, 分装于合适容器 , 121 ℃ 高压灭菌 15min 。
附加说明：
本标准由中华人民共和国国家进出口商品检验局提出。
本标准由中华人民共和国河南进出口商品检验局、湖南进出口商品检验局负责起草 本标准主要起草人李志培、邓明义。
本标准主要参考美国食品和药物管理局 (FDA) 《细菌学分析手册》第 6 版第 4 章 (1984 年 ) 。
中华人民共和国国家进出口商品检验局 1992-12-28 批准 1993-05-01 实施
