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食品中沙门氏菌检验(2)—沙门氏菌生化鉴定

纪旭艳、王娟
录入时间:2021-3-3 11:46:55 来源:青岛海博生物

一、参考标准


  《GB4789.4-2016食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验》


二、沙门氏菌生化鉴定简介


  沙门氏菌生化反应较为复杂,不同的种群生化反应存在差异,参照标准可分为三步进行确认:第一步通过三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶反应进行初步筛选,第二步结合靛基质试验、尿素酶试验、氰化钾试验结果进行确认,若第二步仍不能确认鉴定结果,根据第一第二步的生化反应类型,可分为六种反应类型,再进行第三步的补充试验进行确认。


三、接种步骤



沙门氏菌生化鉴定结果判断流程图


  用接种针挑取沙门氏菌分离平板上的可疑菌落,划线并穿刺接种至三糖铁琼脂斜面,同时接种赖氨酸脱羧酶培养基及氨基酸脱羧酶对照培养基,此时可同步接种蛋白胨水(靛基质试验)、尿素酶培养基、氰化钾对照培养基及试验培养基,接种结束后划线至营养琼脂平板,置于相应的培养条件下进行培养。


  注意事项:挑取菌落时,要用接种针挑取可疑菌落中心,避免碰触到其他菌落造成污染;划线接种至营养琼脂平板培养后,注意观察菌落纯度,若出现了不同形态的菌落,说明挑取的菌落不纯,需挑取纯化好的菌落重新进行生化鉴定。


四、生化反应培养基介绍


  (1)三糖铁琼脂


  制备好的三糖铁琼脂应为红色透明固态的高层斜面,接种方式为斜面划线接种加底层穿刺接种。细菌产碱为红色,用“K”表示,产酸为黄色,用“A”表示。若斜面和底层均为红色(产碱),则记为“K/K”;若斜面为红色(产碱),底层黄色(产酸),则记为“K/A”;若斜面和底层均为黄色(产酸),则记为“A/A”;若底层有黑色出现,则为硫化氢+;若出现断层,则为产气+。



  大多数沙门氏菌在三糖铁上的反应为K/A,产气,底层变黑有硫化氢产生;少数不产硫化氢的沙门氏菌在三糖铁上的反应为K/A,产气,底层无黑色出现;极少数分解乳糖的沙门氏菌在三糖铁上的反应为A/A,产气,底层变黑有硫化氢产生。


  注意事项:三糖铁琼脂培养时,斜面部分需要与空气中的氧气发生氧化反应,因此必须选用透气性良好的试管塞;在使用即用型一次性试管时,需开盖透气培养,严禁密闭培养(密闭培养会导致原本应显红色的斜面变成黄色)。详情参考文章:三糖铁琼脂(TSI)试管使用及注意事项


  (2)赖氨酸脱羧酶试验


  此反应必须同时接种氨基酸脱羧酶对照生化管,细菌进行赖氨酸脱羧酶反应时,首先分解培养基中的葡萄糖产酸使培养基变成黄色,然后再分解赖氨酸脱羧产碱,使培养基又变回紫色。因此,当氨基酸脱羧酶对照管变成黄色,赖氨酸脱羧酶生化管紫色时,即为赖氨酸脱羧酶反应阳性;当氨基酸脱羧酶对照管盒赖氨酸脱羧酶生化管均为黄色时,即为赖氨酸脱羧酶反应阴性。


 

  b、e、f:赖氨酸脱羧酶阳性反应,紫色;a、c、d:赖氨酸脱羧酶阴性反应,黄色


  甲型副伤寒沙门氏菌赖氨酸脱羧酶反应为阴性,其他沙门氏菌的赖氨酸脱羧酶反应均为阳性。


  注意事项:接种后需覆盖液体石蜡;必须同时接种氨基酸脱羧酶对照管;若对照管和氨基酸脱羧酶生化管均为紫色,说明试验菌可能为氧化型细菌或产碱型细菌,不能判断该反应的阴阳性。详情参考文章:赖氨酸脱羧酶试验原理及现象


 (3)靛基质试验


 接种待测菌至蛋白胨水培养基中培养结束后,需滴加Kovacs靛基质试剂数滴,若出现玫红色反应,即为靛基质反应阳性。


a、b:靛基质阳性反应,有玫红色环c、d:靛基质阴性反应,有黄色环;e:空白对照


  绝大多数沙门氏菌靛基质反应为阴性,个别沙门氏菌为靛基质阳性变体。


  (4)尿素酶试验


  接种细菌培养结束后,若培养基变玫红色,说明细菌能够分解尿素产碱,即为尿素酶阳性反应,若培养基仍为橙红色或变黄,说明细菌不分解尿素,即为尿素酶阴性反应。


a、b、c、e:尿素酶阴性反应,变黄或橙红色;d:尿素酶阳性反应,变玫红色。


  几乎所有的沙门氏菌尿素酶均为阴性反应,极少出现尿素酶阳性的变体沙门氏菌。


  (5)氰化钾试验


  需同时接种氰化钾对照生化管,若试验菌在无氰化钾的对照管生长(浑浊),在含氰化钾的试验管不生长(澄清),则为氰化钾反应阴性;若试验菌在对照管和试验管均能生长(浑浊),则为氰化钾反应阳性。


d:氰化钾阳性反应,浑浊生长;a、b、c:氰化钾阴性反应,澄清不生长


  注意事项:氰化钾为剧毒产品,操作时需做好防护措施,建议使用商品化培养基更安全;若自行购买氰化钾配制培养基,需格外小心,若出现泄漏,可使用次氯酸钠溶液、84消毒液、漂白粉等进行应急处理。


  (6)甘露醇、山梨醇、水杨苷、卫矛醇发酵:变黄为阳性反应,不变色或变蓝为阴性反应。


a、b、d:糖醇发酵阳性,变黄;c、e:阴性反应,仍为蓝绿色


  (7)丙二酸盐利用试验:变蓝为阳性反应,不变色或变黄为阴性反应。


b、c:丙二酸盐利用试验阳性,变蓝;a:丙二酸盐利用试验阴性,不变色


  (8)ONPG:变黄为阳性反应,不变色为阴性反应。


a、b、e、f:ONPG阳性反应,变黄;c、d、g:ONPG阴性反应,不变色


五、鉴定结果判断


  1.若三糖铁反应出现K/K,可直接排除沙门氏菌;


  2.若三糖铁反应出现A/A,赖氨酸脱羧酶为阴性,可直接排除沙门氏菌;


  3.若三糖铁反应出现A/A,同时赖氨酸脱羧酶为阳性,或三糖铁出现K/A,需结合硫化氢、靛基质、尿素酶、KCN、赖氨酸脱羧酶试验结果进行下一步判断。


  (3.1)若出现以下生化反应结果(H2S通过三糖铁底层是否变黑进行记录判断),可直接判断为典型沙门氏菌属。若KCN、赖氨酸、尿素酶三项有至少两项与下表不符合,可直接排除沙门氏菌。


H2S

靛基质

尿素酶

KCN

赖氨酸

+

-

-

-

+



   典型沙门氏菌生化反应:H2S+,靛基质-,尿素酶-,KCN-,KCN对照浑浊,赖氨酸脱羧酶+,氨基酸脱羧酶对照变黄


  (3.2)若出现以下生化反应结果(靛基质阳性),有可能为沙门氏菌靛基质阳性变体,需补做甘露醇、山梨醇发酵,并做血清学试验。若甘露醇、山梨醇发酵结果为阳性,血清学试验凝集,可确认为沙门氏菌。


H2S

靛基质

尿素酶

KCN

赖氨酸

+

+

-

-

+



  靛基质阳性变体沙门氏菌生化反应:H2S+,靛基质+,尿素酶-,KCN-,KCN对照浑浊,赖氨酸+,氨基酸脱羧酶对照变黄,山梨醇+,甘露醇+



  (3.3)若出现以下生化反应(尿素酶阳性),有可能为沙门氏菌个别突变体,需做血清学试验。若血清学试验符合,可确认为沙门氏菌。


H2S

靛基质

尿素酶

KCN

赖氨酸

+

-

+

-

+



  尿素酶变体沙门氏菌生化反应:H2S+,靛基质-,尿素酶+,KCN-,KCN对照浑浊,赖氨酸+,氨基酸脱羧酶对照变黄


  (3.4)若出现以下生化反应(硫化氢阴性),有可能为不产硫化氢沙门氏菌,需补做ONPG试验。若ONPG为阴性,可确认为沙门氏菌。


H2S

靛基质

尿素酶

KCN

赖氨酸

-

-

-

-

+



  不产硫化氢沙门(非甲型副伤寒沙门氏菌)生化反应:H2S-,靛基质-,尿素酶-,KCN-,KCN对照浑浊,赖氨酸+,赖氨酸脱羧酶对照变黄,ONPG-


  (3.5)若出现以下生化反应(硫化氢阴性,同时赖氨酸脱羧酶阴性),有可能为甲型副伤寒沙门氏菌,需做血清学试验。若血清学试验符合甲型副伤寒沙门氏菌特征,可确认为甲型副伤寒沙门菌。


H2S

靛基质

尿素酶

KCN

赖氨酸

-

-

-

-

-



  甲型副伤寒沙门菌生化反应:H2S-,靛基质-,尿素酶-,KCN-,KCN对照浑浊,赖氨酸-,氨基酸脱羧酶对照变黄


  (3.6)若出现以下生化反应(KCN阳性),可能为沙门氏菌IV群或V群,需补做卫矛醇、山梨醇、水杨苷、ONPG、丙二酸盐试验。若生化鉴定结果符合IV型或V型,可确认为沙门氏菌。


H2S

靛基质

尿素酶

KCN

赖氨酸

+

-

-

+

+


   沙门氏菌IV群和V群生化反应:


项目

卫矛醇

山梨醇

水杨苷

ONPG

丙二酸盐

沙门IV型

-

+

+

-

-

沙门V型

+

+

-

+

-



  沙门氏菌IV群在HBI沙门氏菌生化鉴定条上的反应结果:靛基质-,尿素酶-,KCN+,KCN对照浑浊,赖氨酸+,氨基酸脱羧酶对照变黄,甘露醇+,山梨醇+,水杨苷+,丙二酸盐-,ONPG-,卫矛醇-。



  沙门氏菌V群在HBI沙门氏菌生化鉴定条上的反应结果:靛基质-,尿素酶-,KCN+,KCN对照浑浊,赖氨酸+,氨基酸脱羧酶对照变黄,甘露醇+,山梨醇+,水杨苷-,丙二酸盐-,ONPG+,卫矛醇+。


  附:食品中沙门氏菌检验解析(1)—沙门氏菌分离 点击查看


  注:本文属海博生物原创,未经允许不得转载。

 

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