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营养缺陷互补法筛选



录入时间:2024-7-10 16:31:37 来源:青岛海博生物

若宿主细胞属于某一营养缺陷型,则在培养这种细胞时的培养基中必须加入该营养物质后,细胞才能生长。如果重组后进入这种细胞的外源DNA中除了含有目的基因外再插入一个能表达该营养物质的基因,就实现了营养缺陷互补,使得重组细胞具有完整的代谢能力,培养基中即使不加该营养物质也能生长。如宿主细胞有的缺少亮氨酸合成酶基因,有的缺少色氨酸合成酶基因,通过选择性培养基,就能将重组子从宿主细胞中筛选出来。这种筛选方法就称为营养缺陷互补法。

β-半乳糖苷酶显色反应就是一种利用宿主细胞和重组细胞中β-半乳糖苷酶活性有无,表现出营养缺陷互补,从而能以直观的显色检测方法进行重组子筛选的常用方法。若pUC 质粒载体含有β-半乳糖苷酶基因(lac Z')的调节片段,具有完整乳糖操纵子的菌体能翻译β-半乳糖苷酶(z),如果这个细胞带有未插入目的DNA的pUC19质粒,当培养基中含有 IPTG时,lac I的产物就不能与lac Z'的启动子区域结合,因此,质粒的lac Z'就可以转录和翻译,产生的lac Z蛋白会与染色体DNA编码的一个蛋白形成具有活性的杂合β-半乳糖苷酶,当有底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(x-gal)存在时,x-gal会被杂合的β-半乳糖苷酶水解形成蓝色的产物,即那些带有未插入外源DNA片段的pUC19质粒的菌落呈蓝色。如果pUC19质粒中插入了目的DNA片段,就破坏了lac Z'的结构,导致细胞无法产生功能性的Lac Z蛋白,也就无法形成杂合β-半乳糖苷酶,因而菌落是白色的。据此可以根据菌落的颜色,筛选出含目的基因的重组体。这一方法大大简化了在这种质粒载体中鉴定重组体的工作。

 

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