在现行的国内外药典中,胰酪大豆胨液体培养基主要用于药品的无菌检查,也可用于微生物限度检验(MPN法)、药品的模拟灌装试验、菌种活化等。此培养基营养丰富,同样也可做为基础培养基,加入特定成分进行改进,适用于多种微生物的培养(例如加入血液或血清可用于营养苛求型微生物的培养,加入特定的抗生素可用于某些特定菌群的选择性增菌培养基等,也可加入琼脂制成固体培养基使用)。
一、TSB的名称问题
由于不同标准命名和翻译的问题,导致TSB培养基存在多个名称,例如胰酪大豆胨液体培养基(Trypticase Soy Broth,TSB)、胰蛋白胨大豆肉汤、胰酪胨大豆肉汤、大豆酪蛋白消化物培养基(Soybean Casein Digest Medium,SCDM)、大豆-干酪素消化物培养基等,事实上这些培养基都是相同的配方:胰酪胨17.0g/L(用胰酶消化酪蛋白制成,也可以叫胰蛋白胨、酪蛋白胨,酪蛋白主要存在于奶或哺乳动物的肌肉组织中,因此习惯于将牛奶用胰酶消化制成的蛋白胨叫酪蛋白胨,由动物组织经胰酶消化制成的蛋白胨叫胰蛋白胨,这两种都可以叫胰酪胨),大豆蛋白胨3.0g/L(用木瓜蛋白酶水解大豆制成,因此也叫大豆木瓜蛋白酶水解物、大豆胨),氯化钠5.0g/L,磷酸氢二钾2.5g/L,一水合葡萄糖2.5g/L,也就是EP标准、USP标准、CP标准、GB标准等使用的TSB其实是同一个培养基。就连化妆品标准使用的SCDLP培养基,其实也是以TSB为基础,加入卵磷脂和吐温80制成的。
二、TSB的微生物质控
TSB灵敏度和适用性检查:在无菌检查法部分,质控菌株为枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉,培养温度为20-25℃,接种量不大于100CFU,每株菌接种2个平行管,细菌的培养时间不超过3天,真菌的培养时间不超过5天。而在非无菌产品微生物限度检查:微生物计数部分,当使用MPN法进行计数时,也用到了TSB,在这一部分也要求对TSB进行检查,质控菌株为金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌,接种量不大于100CFU,培养温度为30-35℃,接种2个平行管,同时要求接种对照培养基(无菌检查法部分没有要求接种对照培养基),培养时间不超过3天。多数人使用TSB都是用于无菌检查,因此培养基的质量控制规程基本上是按照无菌检查法部分执行的,并没有注意到微生物限度检查部分的质量控制方法。
三、TSB的灭菌
TSB的灭菌方式:可以采用过滤除菌、高压蒸汽灭菌、辐照灭菌等多种方式均可,但要注意,TSB中含有少量的葡萄糖,特别是高压蒸汽灭菌时,过度的灭菌条件会导致葡萄糖出现不同程度的焦化,因此再进行灭菌时应提前对灭菌程序进行测试,确保执行的灭菌条件对培养基的质量不会造成不良影响。常见的TSB灭菌后出现颜色变深、变黑、pH下降等现象时,一般都是培养基受热过度导致,培养基灭菌结束后应及时取出降温,避免长时间的保温。
四、TSB的保存
在2015版中国药典中,制备好的培养基在2-25℃避光条件下,非密闭容器一般在3周内使用,保存在密闭容器中一般在一年内使用。而在2020版药典中,改为了在2-25℃避光条件下,在验证的效期内使用。TSB相对比较稳定,因含有少量葡萄糖,长期保存过程中pH会有下降,因此为了延长灭菌后的保存期限,应注意防止灭菌过度,pH可适当上调至7.4-7.5,确保培养基在保存期内的pH不会超出范围。TSB的灵敏度和适用性通常在一年保存期内不会有明显的变化。
五、TSB培养基灵敏度和适用性检查常见问题
在进行TSB的阳性菌接种测试时,经常遇到枯草芽孢杆菌不生长、白色念珠菌不生长,或者黑曲霉不生长的情况。或者做方法验证时使用洋葱伯克霍尔德氏菌、铜绿假单胞菌等进行接种测试,也可能遇到不生长的情况。这些情况并不一定是培养基质量的问题,大概率可能是缺氧导致。枯草芽孢杆菌是需氧菌,而白色念珠菌和黑曲霉是真核生物进行有氧呼吸,它们都需要充足的氧气才能较好的生长,一旦氧气不足,就可能导致生长缓慢或者不生长的现象出现。
(1)容器:装TSB的容器,应确保有足够的空气。若使用试管装TSB,最好使用粗一些的试管,装量通常在1/3左右,一般不超过1/2,使用透气的硅胶塞。若使用瓶装,上方应留有一定量的空气,锥形瓶可以使用透气塞,输液瓶培养时也可以在胶塞上插针头过滤器(一方面可以有充足的氧气,另一方面可能遇到微生物产气的现象,及时排出气体防止崩塞)。
(2)振荡:培养基长时间静置培养,可能逐渐导致底层氧气不足,微生物生长缓慢,因此在逐日观察结果期间,可将TSB轻轻振荡后再观察,一方面可以将沉底的菌体摇起来分散开方便观察,另一方面可以使氧气进入培养基中,有利于微生物的快速生长。
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