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GB 14963—2011 嗜渗酵母计数



录入时间:2011-10-12 8:46:49 来源:互联网

 

GB 14963—2011

附录A

嗜渗酵母计数

A.1 设备和材料

除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:

A.1.1 恒温培养箱:25℃±1 ℃。

A.1.2 冰箱:2℃~5 ℃。

A.1.3 均质器及无菌均质袋、均质杯或灭菌乳钵。

A.1.4 天平: 感量0.1g

A.1.5 无菌试管:18mm×180 mm

A.1.6 无菌吸管:1mL(具 0.01mL 刻度),10 mL(具 0.1mL 刻度),或微量移液器及吸头。

A.1.7 无菌锥形瓶:500mL250mL

A.1.8 无菌培养皿:直径 90mm

A.1.9 无菌 L 型涂布棒:玻璃、塑料或者不锈钢材料制成,棒体直径不应大于 2 mm

A.1.10 显微镜: 10×~100×。

A.2 培养基和试剂

A.2.1 30%葡萄糖溶液(pH 6.5±0.5

A.2.1.1 成分

无水葡萄糖 30.0g

蒸馏水 100mL

A.2.1.2 制法

称量适量葡萄糖,溶解在蒸馏水中,必要时调节 pH 6.4左右。分装后,115℃高压灭菌 20min

A.2.2 氯硝胺 18%甘油( DG18)琼脂

A.2.2.1 成分

酪蛋白胨 5.0g

无水葡萄糖 10.0 g

磷酸二氢钾 1.0g

硫酸镁(MgSO4·H2O 0.5g

氯硝胺 0.002g

无水甘油 200g

琼脂 15g

氯霉素 0.1g

蒸馏水 1000mL

A.2.2.2 制法

除氯霉素外,将全部成分加热煮沸至完全溶解,如有必要,调节 pH 6.4左右。加入抗菌素,121 ℃高压灭菌 15 min,最终的 pH 应为 5.6±0.2。灭菌后,立即在 44 ℃~47℃水浴冷却至 50 ℃以下,在每个灭菌平皿中倾注大约 15 mL20mL 培养基,放置在水平的台面上冷却固化备用。如有必要,可以放在 36℃培养箱中过夜,使琼脂表面干燥无水珠。避光保存。

A.3 检验程序

A.4 操作步骤

A.4.1样品采集和保存

样品采集后,应尽可能及时检验。若不能及时检验,普通样品应置 2℃~5℃冰箱保存,在 24h 内检验。冷冻样品应在 45℃以下不超过 15min 或在 2 ℃~5 ℃不超过 18 h解冻。

A.4.2 样品稀释

A.4.2.1 取样

以无菌操作在天平上称取固体或液体检样 25 g,加入 30%葡萄糖稀释液 225g,用旋转刀片式均质器以 8000 r/min 均质 1min,或拍击式均质器拍击 2 min,制备成 1:10 的均匀稀释液。如无均质器,则将样品放入加有玻璃珠的无菌锥形瓶中,并充分振荡。

A.4.2.2 梯度稀释

用灭菌吸管吸取 1:10 稀释液 1mL,注入含有 9mL 30%葡萄糖稀释液的试管内,置于漩涡混悬仪上混匀,制备 1:100的稀释液。另取 1mL 灭菌吸管,按前操作依次制备 10倍递增稀释液,每递增稀释一次,换用1 1 mL 灭菌吸管。

A.4.3 涂布和培养

A.4.3.1 根据对检样污染情况的估计,选择 2个~3个连续的适宜稀释度,每个稀释度接种 2 DG18 琼脂平板。在充分混合稀释液之后,立即在每个平板表面接种 0.1mL,接着用无菌的 L 型涂布棒进行充分的琼脂表面涂布。注意涂布棒下端不得触碰培养皿的侧缘。进行样品检验的同时,应同时在2 DG18 琼脂平板表面接种 0.1mL 的稀释液作为空白对照。

A.4.3.2 接种完成后,尽快将全部平板置 25 ℃±1 ℃恒温箱内避光培养。培养时勿翻转培养皿。为防止出现霉菌的过度蔓延生长掩盖了目标菌落,在培养 48 h后,即开始每日观察平板上面真菌生长情况。培养 7 d结束。

A.4.4 菌落计数

A.4.4.1 选择菌落数量在 15150之间的平板,计数菌落数量。

A.4.4.2 典型的嗜渗酵母在 DG18 琼脂平板上呈现为圆形、中心隆起、不透明、边缘整齐的菌落,直径 1 mm2 mm。必要时,可利用低倍显微镜直接观察平板上生长的菌落是否为细菌菌落。如出现霉菌菌落干扰时,不应计数丝状菌落。

A.4.5 报告

参照GB 4789.2的报告方式,以 CFUg 为单位报告样品中嗜渗酵母的数量。

 

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