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枯草芽孢杆菌的高效转化方法



录入时间:2011-10-31 9:26:14 来源:互联网

 

高渗透法 

1、准备

40mlLB+0.5M山梨醇):蛋白胨10g/l,酵母粉5g/lNaCl 10g/l3.6g山梨醇pH=7.2

200ml电转培养基(0.5M山梨醇,0.5M甘露醇,10%葡萄糖):18g 山梨醇,18.5g甘露醇,20g葡萄糖。

10ml RM0.5M山梨醇,0.38M甘露醇):0.9g山梨醇,0.7g甘露醇。

250ml离心管,灭菌。

2、转化

1)接种B.subtilis3mlLB培养基中,过夜培养.

2)取2.6ml过夜培养物接入40mlLB+0.5M 山梨醇)中,37℃,200rpm培养至OD600=0.85~0.95

3)将菌液冰水浴10 min,然后5000g5 min4℃离心收集菌体。

4)用50ml预冷的电转培养基(0.5M山梨醇,0.5M甘露醇,10%葡萄糖),重新吹悬菌体,5000g5min4℃离心去上清,如此漂洗4次。

5)将洗涤后的菌体吹悬于1ml电转培养基中,每EP管分装120

6)将60μl感受态细胞中加入50ngDNA1~8μl),冰上孵育2min,加入预冷的电转杯(1mm)中,电击一次。电转仪设置:2.0kv1mm,电击1次。(电击结果:时间常数=4.5~5.0ms,如果时间常数<4.2,则需要增加电转培养基的漂洗次数或者提高感受态的稀释倍数,来获得更高的转化效率)。

7)电击完毕取出杯子并立即加入1ml RMLB+0.5M山梨醇+0.38甘露醇),37℃,200rpm,复苏3h后,涂板。37℃,过夜培养。

 

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