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生淀粉酶细菌菌株的筛选及其酶学性质研究



录入时间:2015-7-8 11:17:53 来源:青岛农业大学

生淀粉糖化酶一般指可以直接作用、水解或糖化未经蒸煮的淀粉颗粒的酶,可能包括α-淀粉酶、β淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、普鲁兰酶。它可以将淀粉传统工艺中的糊化、液化和糖化合并为一步直接进行糖化,如果将其应用于无蒸煮的酒精发酵,可节约总能耗的30%~40%。已发现的能产生淀粉酶的微生物种类较多,报道最多的是黑曲霉、根霉和芽孢杆菌。本文筛选出能产生淀粉酶的细菌,对其进行初步鉴定,并进行了酶学性质的研究。

1   材料与方法

1.1  土样

     校内食堂垃圾附近的土壤。

1.2  培养基

     平板分离培养基:可溶性淀粉3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、琼脂20g、蒸馏水1000ml,pH7.2~7.4,121℃灭菌20min。其中可溶性淀粉在105℃下干热灭菌2h,然后在65℃下无菌操作加入。

液体发酵培养基:可溶性淀粉3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、蒸馏水1000ml,pH7.2~7.4,121℃灭菌20min。其中可溶性淀粉在105℃下干热灭菌2h,然后在常温下无菌操作加入。

1.3 菌种筛选方法

    初筛:变色圈法,选择圈径比较大的菌落,进一步划线分离后,进行产酶测定。

    复筛:测酶活,选择酶活高的菌株作为目的菌株。

1.4 生淀粉酶活的测定方法

    酶活力测定方法:将发酵液在4℃,8000r/min下,离心30min后取出上清液,再通过抽滤得到的滤液为粗酶液,取1ml粗酶液,加入到19mLpH6.5的柠檬酸盐缓冲液中,再加入0.5g的可溶性淀粉为底物,30℃水解2h后用0.5ml4%的NaOH溶液终止反应,反应液在4000r/min下离心5min,用DNS法测定上清液中还原糖的含量,测定540nm处的吸光度(在酶活测定体系中,以纯水取代粗酶液作为空白),查葡萄糖标准曲线得到水解产物中的葡萄糖量,从而确定生淀粉酶的酶活力大小。

酶活力定义:在pH6.5、温度为30℃保温120min条件下,1min产生1ug葡萄糖所需要的酶的量规定为1个酶活力单位(U)。

1.5 菌种鉴定

   进行形态和生理生化检测。

1.6 生淀粉糖化酶的酶学性质研究

1.6.1 酶的热稳定性研究 取一定量的粗酶液,分别在50℃、60℃、70℃和80℃不同温度下保温60min,每隔10min测定残留酶活力。

1.6.3 pH的影响  配制pH分别为3.0、3.6、4.0、4.6、5.0、5.6、6.0、6.6、7.0、7.6、8.0和8.6的柠檬酸盐缓冲液,在不同pH缓冲液中让酶水解生淀粉,通过水解产物中葡萄糖的量计算酶活力的大小。

1.6.4 酶的pH稳定性研究  将酶溶于pH6.5的柠檬酸盐缓冲液中,分别放置1、2、4、6、9、12、24、36、48和60h后,测定残余物的酶活力大小。

1.6.5 金属离子的影响  以不加金属离子为对照,分别在反应液中加入1mmol/L的Ca2+、Na+、Mg2+、Fe3+、K+、Mn2+、Zn2+和Cu2+,测定酶活。

2  结果与分析

2.1 菌种筛选

    从初筛平板上挑出了8株有较大淀粉水解圈的菌株,分别编号为QD001到QD008。测得它们各自的圈径比见表1,对圈径比较大的菌株QD001、QD006和QD007做斜面保藏并通过摇瓶复筛,得到QD006酶活力最高,达到10、18U/ml,确定为目标菌株。

2.2  菌种鉴定

     QD006的菌落较小,较薄,较透明且“细腻”,边缘光滑,革兰氏染色确定该菌为革兰氏阳性菌,经显微观察呈球形,为球菌;糖类发酵试验显示改菌能利用葡萄糖,蔗糖,但不能利用乳糖:VP试验为阴性;MR试验为阴性;吲哚试验为阴性;柠檬酸盐为阴性。初步鉴定该菌为Staphylococcus intermedius。

2.3生淀粉糖化酶的酶学性质

2.3.1 温度对酶活的影响

   由图1可知,酶的最适作用温度为50℃。当温度小于50℃时,反应速率随温度升高而升高,但高于最适温度,酶的反应速率下降。

2.3.2 生淀粉糖化酶的热稳定性

    由图2可知,该生淀粉糖化酶在50℃和60℃时,放置1h后,残余酶活分别是99.8%和98.2%,由此可知,在60℃内,该生淀粉糖化酶具有很好的热稳定性。

 

2.3.3 pH对酶活力的影响

    由图3可知,该酶的最适为6.5左右,同时可以看出pH在3-4.5的范围内,生淀粉糖化酶的酶活变化不大,上升趋势比较小,但pH对生淀粉糖化酶的影响呈现出明显的钟罩形。

 

2.3.4 酶的耐酸稳定性

    由图4可知,该生淀粉糖化酶在pH6.5的柠檬酸盐缓冲液中放置1、2、5h后,残余的酶活力都在70%以上,随着放置时间的延长,酶活力迅速降低,放置60h,残余的酶活力仅在10%左右,所以该酶的耐酸稳定性比较弱。

2.3.5 金属离子对生淀粉糖化酶的酶活力的影响

由表2可知,Ca2+、Na+、K+、对该生淀粉糖化酶有激活作用,Fe3+、Zn2+、Cu2+ 对该酶有抑制作用。

 

3  结论

   从自然界分离得到产生淀粉酶的菌株QD006,通过形态和生理生化鉴定,初步确定为Staphylococcus intermedius,经对该酶酶学性质的研究,其最适温度为50℃,最适pH为6.5,并且具有良好的热稳定性,Ca2+、Na+、K+、对该生淀粉糖化酶有激活作用,Fe3+、Zn2+、Cu2+ 对该酶有抑制作用。

 

 

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