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产气荚膜梭菌(一)样品稀释和分离操作


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1.样品采集后应尽快检验,若不能及时检验,可在2℃~5℃保存;如8 h内不能进行检验,应以无菌操作称取25 g(mL)样品加入等量缓冲甘油-氯化钠溶液(液体样品应加双料),并尽快至于-60℃低温冰箱中冷冻保存或加干冰保存。
注意事项:产气荚膜梭菌为厌氧菌,暴露在空气中易死亡,因此从称样、制备样液、稀释、到倾注培养基进行培养整个过程要快速完成,如不能及时完成,可按标准要求置于2-5℃保存(数小时内)或加入缓冲-甘油氯化钠溶液置于-60℃冷冻保存。
2.以无菌操作称取25 g(mL)样品放入含有225 mL 0.1%蛋白胨水(如为1中冷冻保存样品,室温解冻后,加入200 mL 0.1%蛋白胨水)的均质袋中,在拍击式均质器上连续均质1 min~2 min;或置于盛有225 mL0.1%蛋白胨水的均质杯中,8 000 r/min~10 000 r/min均质1 min~2 min,作为1:10稀释液。
3.以上述1:10稀释液按1 mL加0.1%蛋白胨水9 mL制备10-2~10-6的系列稀释液。
4.吸取各稀释液1 mL加入无菌平皿内,每个稀释度做两个平行。每个平皿倾注冷却至50℃的TSC琼脂(可放置于50 ℃±1 ℃恒温水浴箱中保温)15 mL,缓慢旋转平皿,使稀释液和琼脂充分混匀。
注意事项:注意倾注时的培养基温度和时间,培养基温度过高或操作时间过长都有可能导致产气荚膜梭菌死亡;
5.上述琼脂平板凝固后,再加10 mL冷却至50℃的TSC琼脂(可放置于50℃±1℃恒温水浴箱中保温)均匀覆盖平板表层。
注意事项:部分产气荚膜梭菌若生长在培养基表面时会因产生的硫化氢逃逸,菌落呈现无色,导致漏检,覆盖培养基则可以留住硫化氢与培养基中的铁盐反应生成黑色的FeS,使菌落呈现黑色,因此必须要进行覆盖操作。
6.待琼脂凝固后,正置于厌氧培养装置内,36℃±1℃培养20 h~24 h。
7.典型的产气荚膜梭菌在TSC琼脂平板上为黑色菌落。

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