1）退火温度不合适。以2度为梯度设计梯度PCR反应优化退火温度。（2）DNA模板量太少。增加DNA模板量。（3）PCR循环数不足。增加反应循环数。（4）引物量不足。增加体系中引物含量。（5）延伸时间太短。以1kb/分钟的原则设置延伸时间。（6）变性时间过长。变性时间过长会导致DNA聚合酶失活。（7）DNA模板中存在抑制剂。确保DNA模板干净